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葡萄醛脱氢酶基因ALDH2B8表达及功能研究

作　者: 徐晓召
导　师: 王西平
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄醛脱氢酶氧化胁迫盐胁迫脂膜过氧化
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

葡萄是世界性的重要水果。全球水资源匮乏，加上环境污染、土地盐碱及荒漠化严重，对葡萄及至整个作物的产量和品质造成了严重的影响。植物在遭受干旱、盐等非生物逆境胁迫时会产生大量的醛类物质，从而对细胞造成不可逆的伤害。依赖于NAD（P）+的醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase, ALDH）能将细胞内的醛类物质不可逆的氧化为对应的羧酸，从而减轻高活性醛类分子对植物造成的伤害，这在植物抵御逆境胁迫起着非常重要的作用。醛脱氢酶家族在植物抗逆中的功能在拟南芥、水稻、大豆上已得到验证。但关于葡萄醛脱氢酶基因功能研究还少见报道，本研究从葡萄中分离盐胁迫响应基因ALDH2B8，并对其表达及功能进行了分析。取得的主要成果如下：1.采用实时定量PCR技术分析ALDH2B8在欧美杂种葡萄巨峰受盐胁迫后叶片中的表达情况。结果表明ALDH2B8在巨峰叶片中受盐胁迫诱导先上调表达，再回到正常水平，上调表达最大值出现在胁迫处理后3h，胁迫后3h、6h和12h的表达量都显著高于对照，胁迫后24h至48h表达量下降，和对照无明显差异。实时定量PCR分析ALDH2B8在欧美杂种葡萄巨峰不同组织表达结果表明，ALDH2B8在果实中表达量最低，在花中表达量最高，在根、茎、叶、卷须中次之。2.采用同源序列法设计引物克隆获得葡萄ALDH2B8完整的开放阅读框，其长度为1617bp，编码538个氨基酸。该基因核苷酸序列与已公布欧洲葡萄ALDH2B8序列同源性为99.63%，氨基酸序列同源性为100%。氨基酸序列同源性分析表明：葡萄ALDH2B8与中国野葡萄华东葡萄醛脱氢酶ALDH2B4（GenBank登录号：AAZ79355）的同源性为79.11%，与玉米醛脱氢酶（GenBank登录号：NP₀01105891）的同源性为75.89%,与水稻醛脱氢酶（GenBank登录号：NP₀01105891）的同源性为71.61%,与人醛脱氢酶（GenBank登录号：AAT41621）的同源性为53.21%。3.采用PEG介导的瞬时转化技术检测ALDH2B8在拟南芥原生质体中的定位。结果表明，ALDH2B8定位于线粒体。4.采用农杆菌介导法获得转化葡萄ALDH2B8基因的拟南芥株系，转基因拟南芥能提高对氧化胁迫抗性，能在盐胁迫下延长生命周期。进一步研究发现该抗性与活性氧及丙二醛含量降低有关。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 气候变化与环境胁迫  11
  1.2 植物胁迫反应及抗性机理  11
  1.3 非生物胁迫相关基因产物  11-12
  1.4 植物胁迫相关基因的表达调控  12-13
    1.4.1 渗透及氧化胁迫信号途径  12
    1.4.2 Ca~(2+)信号途径  12-13
    1.4.3 SOS 信号途径  13
  1.5 ABA 信号途径  13
  1.6 胁迫诱导蛋白及渗透调节物质  13-14
    1.6.1 LEA 蛋白  14
    1.6.2 渗透调节物质  14
  1.7 活性氧（ROS）  14
  1.8 醛类分子与脂膜过氧化  14-15
  1.9 醛脱氢酶研究进展  15-17
    1.9.1 醛脱氢酶在抗逆方面功能研究  16-17
    1.9.2 醛脱氢酶是一种 ROS 清除剂  17
  1.10 研究目的及意义  17-19
第二章葡萄醛脱氢酶基因 ALDH2B8 克隆及表达分析  19-25
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 植物材料  19
    2.1.2 引物  19
    2.1.3 主要酶、化学试剂及仪器设备  19
    2.1.4 质粒及菌种  19-20
    2.1.5 测序  20
  2.2 方法  20-21
    2.2.1 材料处理  20
    2.2.2 总 RNA 提取  20
    2.2.3 cDNA 第一链的合成  20
    2.2.4 qRT-PCR 检测盐胁迫处理后葡萄 ALDH2B8 基因表达  20-21
    2.2.5 葡萄 ALDH2B8 基因克隆及测序  21
  2.3 结果与分析  21-24
    2.3.1 葡萄 ALDH2B8 基因在不同组织器官中的表达分析  21-22
    2.3.2 葡萄 ALDH2B8 基因盐胁迫处理后的表达模式分析  22
    2.3.3 葡萄 ALDH2B8 基因克隆  22-23
    2.3.4 葡萄 ALDH2B8 基因序列分析  23-24
  2.4 讨论  24-25
第三章葡萄 ALDH2B8 亚细胞定位分析  25-30
  3.1 材料  25
    3.1.1 引物  25
    3.1.2 植物材料  25
    3.1.3 主要酶、化学试剂及仪器设备  25
    3.1.4 质粒及菌种  25
    3.1.5 测序  25
  3.2 方法  25-26
    3.2.1 葡萄 ALDH2B8 基因克隆及测序  25-26
    3.2.2 葡萄 ALDH2B8 亚细胞定位载体构建  26
    3.2.3 拟南芥原生质体制备及 PEG 转染  26
    3.2.4 线粒体染色及检测  26
  3.3 结果  26-29
    3.3.1 葡萄 ALDH2B8 基因克隆及融合表达载体构建  26-28
    3.3.2 葡萄 ALDH2B8 线粒体定位分析  28-29
  3.4 讨论  29-30
第四章葡萄 ALDH2B8 转基因拟南芥抗逆功能研究  30-40
  4.1 材料  30
    4.1.1 引物  30
    4.1.2 植物材料  30
    4.1.3 主要化学试剂及仪器设备  30
    4.1.4 质粒及菌种  30
  4.2 方法  30-33
    4.2.1 葡萄 ALDH2B8 基因过量表达载体构建  30-31
    4.2.2 农杆菌感受态细胞的制备  31
    4.2.3 农杆菌的转化  31
    4.2.4 菌液 PCR 检测  31-32
    4.2.5 蘸花法转化拟南芥  32
    4.2.6 转基因拟南芥分子水平检测  32
    4.2.7 转基因拟南芥抗逆性鉴定  32
    4.2.8 MDA 及叶绿素含量测定  32-33
    4.2.9 超氧阴离子（O~(2–)）和过氧化氢（H_2O_2）定性测定  33
  4.3 结果  33-38
    4.3.1 葡萄醛脱氢酶 ALDH2B8 植物过量表达载体构建  33-34
    4.3.2 拟南芥转化及转基因阳性植株获得  34-35
    4.3.3 葡萄 ALDH2B8 在转基因拟南芥 PCR 阳性植株中的表达分析  35-36
    4.3.4 葡萄 ALDH2B8 转基因拟南芥抗逆性分析  36-38
  4.4 讨论  38-40
第五章结论  40-41
参考文献  41-47
致谢  47-48
作者简介  48

葡萄醛脱氢酶基因ALDH2B8表达及功能研究

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