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果梅花柱S-RNase特性及其抑制自花花粉管生长的机制

作　者: 杜玉虎
导　师: 张绍铃
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 果梅 自交不亲和性 S-RNase 花粉管 蛋白质纯化 RNA降解
分类号: S662.4
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


本文以果梅‘细叶青’、‘莺宿’等为试材，应用田间授粉、花粉离体培养、花粉管原位荧光显微观察、离子柱层析蛋白分离技术、凝胶电泳技术（IEF-和SDS-PAGE）、RNA离体降解反应等生物学研究方法，研究了果梅不同品种及花不同发育阶段自交不亲和性强度差异及其与花柱S-RNase含量的关系；果梅雌蕊花柱S基因蛋白产物S-RNase的分离纯化及其特性；果梅花粉离体萌发生长特性及S-RNase对其抑制的机制等。主要结果如下：1．果梅10个品种自交不亲和性强度的差异通过田间自花授粉坐果率、花粉管荧光显微镜观察和花柱S-RNase含量测定的结果表明，果梅品种自交不亲和性强度存在差异，自交不亲和性强的品种：‘南高’；中：‘莺宿’、‘月世界’、‘细叶青’和‘南红’；弱：‘丰后’、‘软条红梅’和‘小叶猪肝’。‘藤五郎’和‘八郎’属于自交亲和性品种，但雌蕊S基因蛋白产物S-RNase在花柱中能够正常合成。2．果梅花不同发育阶段花柱内s-RNase含量的差异及其与自交不亲和性强度的关系果梅‘细叶青’花柱s-RNase从开花前6d开始合成，开花前4d已有一定量合成（21.4ng／花柱），大量合成在开花前2-3d到开花当天（34.5ng／d），开花当天含量最高（129.4ng／花柱），并且开花后S-RNase开始被缓慢降解（开花后2d为105.7ng／花柱）。花不同发育阶段自花授粉坐果率及生长到花柱基部自花花粉管数量也表现出一致的结果：从开花前4d开始具备弱的自交不亲和性，并且随着花的发育逐渐增强，开花当天最强，开花后开始减弱。蕾期自花授粉以开花前2d为宜。生长到花柱基部花粉管数量正相关于自花授粉坐果率（r=0.8615）；花柱S-RNase含量和二者都呈现出极显著负相关关系(r=-0.9640**、r=-0.9380**)。花柱S-RNase含量是影响果梅自交不亲和性强弱的主要原因。3．果梅成熟花柱S-RNase含量及其特性果梅‘细叶青’S-RNase特异性存在于雌蕊组织，花柱中大量存在，子房中微量存在，在花药、花瓣、萼片、花托、芽和幼果中未能检测到其存在。应用CM和SP离子层析柱可以纯化果梅花柱S-RNase，纯度86％-96％，平均提取量为130.9μg／g。依据果梅不同组织器官和花发育不同时期S-RNase含量特点、核酸酶活性和回收S-RNase蛋白，确定了S-RNase在SDS-PAGE凝胶上的位置，分子量为32kD左右。4．果梅花粉离体萌发及花粉管生长的特性果梅‘细叶青’花粉萌发及花粉管生长最适宜的液体培养基为30mmol／L MES（pH6.5）缓冲液中含20％蔗糖，0.01％硼酸，20％PEG-4000，0.03％Ca（N03）2·4H2O，0.02％MgSO4·7H2O；花粉萌发率为45.0％，花粉管长度为597.2pm。另外，适于培养果梅花粉的密度和温度分别为：20-80粒／μl和25℃。5．花柱S-RNase抑制花粉萌发及花粉管生长的特性果梅‘月世界’0.0028 U·μl-1的花柱S-RNase能够特异性抑制自花花粉离体萌发和花粉管生长；这种特异性随着培养温度的升高和S-RNase活性增加而下降或消失：35℃时特异性消失、活性大于0.0046 U·μl-1时，开始抑制异花花粉萌发和管生长。外源RNase A能够抑制离体花粉的萌发和管生长，不合S-RNase的花柱可溶性蛋白却不具有此生理功能。6．花柱S-RNase降解自花花粉管RNA的特性离体条件下果梅‘月世界’花柱S-RNase能够特异性地降解自花花粉管的RNA，但随着时间延长异花花粉管RNA也被降解，说明S-RNase可能没有底物特异性，但可能存在底物降解速率特异性；这种降解特异性随着S-RNase活性提高，以及反应温度的提高而下降甚至消失。不含S-RNase的花柱可溶性蛋白和RNaseA均能够无特异性地降解花粉管RNA，其中RNase A的降解作用略强。因此，推论S-RNase特异性的降解自花花粉管RNA，从而抑制了自花花粉管生长。本文首次对果梅不同品种和花不同发育阶段的自交不亲和性强度进行了分析；从雌蕊S-RNase纯化、特性和功能的角度对果梅自交不亲和性进行了较为系统的研究；最先从果梅中纯化了花柱S-RNase。研究结果进一步揭示了果梅属于S-RNase介导的配子体型自交不亲和性果树，提出了花柱S-RNase特异性的降解花粉管RNA而导致自花花粉管停止生长的生理机制，进一步充实了蔷薇科植物配子体型自交不亲和性机理的学术理论。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩写词表  13-14
引言  14-18
第一章 文献综述  18-32
  第一节 植物配子体型自交不亲和性研究进展  18-27
    1 配子体型自交不亲和性雌蕊S基因  19
    2 S-RNase结构、生化特性和功能  19-21
    3 配子体型自交不亲和性雌蕊S基因表达特性  21-22
    4 配子体型自交不亲和性花粉特异性决定因子  22-23
    5 配子体型自交不亲和性的修饰因子  23-24
    6 配子体型自交不亲和性机制模型  24-27
  第二节 果梅自交不亲和性研究进展  27-32
    1 果梅自交不亲和性的表现  27
    2 果梅自交不亲和性基因的鉴定  27-29
    3 果梅SLF/SFB基因结构特点  29
    4 果梅自交亲和性的分子标记  29
    5 果梅自交亲和性研究展望  29-32
第二章 不同果梅品种及花发育阶段的自交不亲和性强度的差异  32-52
  第一节 果梅不同品种自花授粉坐果率的差异  32-35
    1 材料与方法  32-33
    2 结果与分析  33-34
      2.1 直接套袋法坐果率  33
      2.2 点授花粉法坐果率  33
      2.3 直接套袋法和点授花粉法间坐果率的差异  33-34
    3 讨论  34-35
  第二节 果梅花不同发育阶段自花、异花授粉结果率的比较  35-38
    1 材料与方法  35
    2 结果与分析  35-37
    3 讨论  37-38
  第三节 果梅不同品种自花授粉后花粉原位萌发及生长的特性  38-45
    1 材料与方法  38-39
    2 结果与分析  39-43
      2.1 离体条件下不同品种花粉萌发率和花粉管生长的差异  39-40
      2.2 不同品种自花花粉在柱头上的萌发率比较  40-41
      2.3 不同品种自花花粉管生长到花柱上部数量的差异  41
      2.4 不同品种自花花粉管生长到花柱中部数量的差异  41-42
      2.5 不同品种自花花粉管生长到花柱基部数量的差异  42-43
    3 讨论  43-45
  第四节 果梅花不同发育阶段自花与异花授粉后花粉原位萌发特性的差异  45-52
    1 材料与方法  45-46
    2 结果与分析  46-49
      2.1 不同发育阶段花的自花、异花花粉原位萌发的差异  46-47
      2.2 不同发育阶段花授粉后到达花柱上部的自花、异花花粉管数量的差异  47
      2.3 不同发育阶段花授粉后到达花柱中部的自花、异花花粉管数量的差异  47-48
      2.4 不同发育阶段花授粉后到达花柱基部的自花、异花花粉管数量的差异  48-49
    3 讨论  49-52
      3.1 果梅有效授粉期  49-51
      3.2 果梅花粉萌发和花粉管生长特性及自交适宜授粉期  51-52
第三章 果梅花柱S-RNase含量及其与自交不亲和性的关系  52-70
  第一节 果梅不同组织器官S-RNase含量的差异  52-55
    1 材料与方法  52-53
    2 结果与分析  53-54
      2.1 果梅不同组织及幼叶蛋白质含量  53
      2.2 不同组织器官S-RNase含量差异  53-54
    3 讨论  54-55
  第二节 果梅不同品种花柱S-RNase含量及其与自交不亲和性强度的关系  55-63
    1 材料与方法  55-56
    2 结果与分析  56-61
      2.1 不同品种花柱重量和长度  56-57
      2.2 不同品种花柱可溶性蛋白质含量的差异  57-58
      2.3 不同品种花柱S-RNase含量的比较  58-59
      2.4 不同品种花柱S-RNase含量与自花授粉坐果率及达到花柱基部花粉管数量的关系  59-61
    3 讨论  61-63
  第三节 果梅花不同发育阶段花柱S-RNase含量及其与自交不亲和性强度的关系  63-70
    1 材料与方法  63-64
    2 结果与分析  64-68
      2.1 ‘细叶青’花不同发育阶段花柱重量和长度  64
      2.2 不同发育阶段花柱可溶性蛋白含量的差异  64-65
      2.3 花不同发育阶段花柱S-RNase含量  65-67
      2.4 自花授粉坐果率、达到花柱基部花粉管数量和花柱S-RNase含量间的相关关系  67-68
    3 讨论  68-70
第四章 果梅花柱S-RNase的纯化及特性研究  70-80
  第一节 果梅花柱S-RNase的纯化、等电点及活性测定  70-74
    1 材料与方法  70-71
    2 结果与分析  71-73
      2.1 ‘月世界’花柱S-RNase的纯化及活性测定  71-72
      2.2 ‘细叶青’花柱S-RNase的纯化  72-73
    3 讨论  73-74
  第二节 果梅‘细叶青’花柱S-RNase分子量的确定  74-80
    1 材料与方法  74-75
    2 结果与分析  75-78
      2.1 ‘细叶青’花不同发育阶段花柱可溶性蛋白SDS-PAGE电泳  75-76
      2.2 ‘细叶青’不同组织器官可溶性蛋白SDS-PAGE电泳  76
      2.3 ‘细叶青’花柱S-RNase等SDS-PAGE电泳  76-77
      2.4 ‘细叶青’和‘月世界’花柱S-RNase等SDS-PAGE电泳并活性染色  77-78
    3 讨论  78-80
第五章 果梅花柱S-RNase对花粉离体萌发和花粉管生长的影响  80-100
  第一节 果梅花粉离体萌发和花粉管生长特性研究  80-89
    1 材料与方法  81-82
    2 结果与分析  82-86
      2.1 不同培养基上花粉萌发和花粉管生长的差异  82-83
      2.2 不同花粉培养密度对花粉萌发及生长的影响  83-84
      2.3 不同温度下花粉萌发和花粉管生长随培养时间的变化  84-86
    3 讨论  86-89
      3.1 培养基组分和花粉萌发及花粉管生长的关系  86-87
      3.2 花粉培养密度和花粉萌发及花粉管生长的关系  87
      3.3 培养温度和花粉萌发及花粉管生长的关系  87-89
  第二节 离体条件下果梅花柱S-RNase对花粉萌发和花粉管生长的影响  89-100
    1 材料与方法  89-90
    2 结果与分析  90-96
      2.1 不同活性S-RNase对自花、异花花粉萌发生长的影响  90-91
      2.2 不同核酸酶对花粉萌发和花粉管生长的影响  91-93
      2.3 不同温度条件下花柱S-RNase对花粉离体萌发的影响  93-94
      2.4 不同温度条件下花柱S-RNase对花粉离体花粉管生长的影响  94-96
    3 讨论  96-100
      3.1 花柱S-RNase抑制自花花粉管生长  96-98
      3.2 不同RNase抑制花粉管生长  98
      3.3 温度对S-RNase抑制花粉管生长的影响  98-100
第六章 果梅‘月世界’花柱S-RNase离体条件下对花粉管RNA降解特性的研究  100-110
  第一节 花粉管RNA的提取  100-102
    1 材料与方法  100
    2 结果与分析  100-101
    3 讨论  101-102
  第二节 果梅‘月世界’花柱S-RNase离体条件下降解花粉管RNA特性  102-110
    1 材料与方法  102-103
    2 结果与分析  103-108
      2.1 花柱S-RNase降解花粉管RNA反应的终止条件的筛选  103-104
      2.2 花柱S-RNase特异性降解不亲和花粉管RNA  104-105
      2.3 不同活性果梅花柱S-RNase降解自交不亲和、亲和性花粉管RNA  105
      2.4 花柱S-RNase、酸性蛋白和RNaseA降解自交不亲和、亲和性花粉管RNA  105-106
      2.5 不同温度下果梅花柱S-RNase离体降解花粉管RNA反应  106-107
      2.6 S-RNase对从李叶片中提取的基因组DNA样品中RNA的降解  107-108
    3 讨论  108-110
综合讨论  110-116
  1.果梅品种自交不亲和性强度的差异  110-111
  2.果梅的自交不亲和性强度取决于花柱内S-RNase的含量  111-112
  3.果梅花粉萌发及花粉管生长的特性  112
  4.花柱S-RNase降解自花花粉管RNA导致花粉管停止生长的特性  112-113
  5.需进一步探讨的问题  113-116
全文结论与创新点  116-118
参考文献  118-130
致谢  130-132
在读期间发表的学术论文  132

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 核果类 > 梅
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