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苦参毛状根及愈伤组织培养研究

作　者: 刘瑶
导　师: 齐香君
学　校: 陕西科技大学
专　业: 生物化工
关键词: 苦参愈伤组织毛状根苦参碱氧化苦参碱
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

苦参（Sophora flavescens Ait.）为豆科（Leguminosae）槐属（Sophora Linn.）落叶灌木，是我国传统中药之一。主要分布在山西、陕西、北京、黑龙江、甘肃、河北、湖南、广西、四川等地。苦参具有清热燥湿、杀虫、利尿等功能。现代医学研究表明，苦参中的苦参碱和氧化苦参碱具有良好的抗癌活性，对黑色素瘤、膀胱癌、胃癌等均有不同程度的抑制作用，目前以苦参和其有效成分为原料开发了多种制剂并广泛用于临床。苦参生长周期需2-3年，加之苦参制剂的深度开发，苦参药材的市场需求量不断增加，其价格由2003的2.5元涨到2011的14元左右，在近几年内翻了4倍多，突显了苦参资源可持续发展的问题。本论文开展苦参毛状根培养体系研究，为解决苦参资源问题探索新途径。本论文研究了苦参毛状根的诱导、继代培养条件及苦参愈伤组织的诱导和增殖培养条件；并采用高效液相色谱分析法，对苦参毛状根及愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱含量进行了测定。研究结果如下：1.高效液相色谱法测定苦参碱及氧化苦参碱含量的色谱条件为：色谱柱：氨基柱（Hypersil NH₂4.6mm×250mm，5μm，柱号：E2021505，批号：9347）；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸（84:8:8）；检测波长：220nm；流速：1mL/min；进样量：15μL；柱温：室温。1)在所述条件下，苦参碱的保留时间为10.2min。苦参碱在10.0²40.0μg/mL范围内，线性关系良好（r=0.9990），加样回收率为97.21%，RSD为1.75%。2)在所述条件下，氧化苦参碱的保留时间为15.9min。氧化苦参碱在10.0²40.0μg/mL的范围内，线性关系良好（r=0.9995），加样回收率为99.12%，RSD为1.90%。2.苦参毛状根的最佳诱导条件为：以幼芽为外植体，在R1601菌液中添加100umol/L乙酰丁香酮，侵染20min，MS培养基，25±1℃暗培养2d。苦参毛状根的诱导率为28.6%。3.苦参毛状根继代培养条件：以改良的1/2MS为培养基，蔗糖为碳源，此条件下苦参毛状根生长较好。苦参毛状根中氧化苦参碱的富集量为1.79mg/g（苦参毛状根干重），未检测到苦参碱。4.苦参愈伤组织最佳诱导条件：以苦参幼芽为外植体，培养基MS+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA中25±1℃条件下暗培养；以苦参幼芽、根、茎、叶片为外植体，其愈伤组织的诱导率分别为94.12%、74.19%、35.71%、23.08%。5.苦参愈伤组织最佳增殖条件：培养基MS+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA，培养温度为25±1℃，黑暗培养；此条件下其增殖率为25.3%。不同激素组合对愈伤组织诱导率的影响不大，但对其增殖率的影响较大，其中激素NAA具有显著影响。对苦参愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱的研究表明，苦参愈伤组织中苦参碱的含量为0.40%，氧化苦参碱的含量4.34%。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
缩写表  9-10
目录  10-13
1 绪论  13-25
  1.1 药用植物苦参的概况  13-14
    1.1.1 生物学特征  13-14
    1.1.2 化学成分研究  14
  1.2 苦参碱及氧化苦参碱的研究概述  14-18
    1.2.1 苦参碱及氧化苦参碱的理化性质  14-15
    1.2.2 苦参碱及氧化苦参碱的人工合成途径研究  15
    1.2.3 苦参碱及氧化苦参碱的提取和含量测定  15-17
    1.2.4 苦参碱及氧化苦参碱的药理作用  17-18
    1.2.5 苦参碱及氧化苦参碱的制剂研究  18
  1.3 药用植物毛状根的研究现状  18-22
    1.3.1 药用植物毛状根诱导的影响因素  20-21
    1.3.2 发根农杆菌转化毛状根的方法  21
    1.3.3 植物毛状根的应用  21-22
  1.4 植物组织培养的研究现状  22-24
    1.4.1 植物组织培养生产次生代谢产物的优点  23
    1.4.2 植物组织培养生产次生代谢产物的应用  23-24
  1.5 本课题研究的目的与意义  24
  1.6 本课题研究的主要内容  24-25
    1.6.1 苦参毛状根诱导及培养条件的研究  24
    1.6.2 苦参愈伤组织诱导及培养条件的研究  24-25
2 苦参愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱分析方法学研究  25-33
  2.1 试验材料与仪器设备  25-26
    2.1.1 试验材料  25
    2.1.2 主要试剂与设备  25-26
  2.2 分析方法  26
    2.2.1 苦参碱及氧化苦参碱的定性分析  26
    2.2.2 苦参碱及氧化苦参碱的定量分析  26
  2.3 研究内容与方法  26-27
    2.3.1 薄层色谱法定性分析苦参碱及氧化苦参碱  26-27
    2.3.2 高效液相色谱法定量分析苦参碱及氧化苦参碱  27
  2.4 结果与分析  27-32
    2.4.1 薄层色谱法定性分析苦参碱及氧化苦参碱  27-28
    2.4.2 高效液相色谱法定量分析苦参碱及氧化苦参碱  28-32
  2.5 小结  32-33
3 苦参毛状根诱导及继代培养研究  33-42
  3.1 试验材料与仪器设备  33-35
    3.1.1 试验材料  33
    3.1.2 试剂及仪器设备  33-35
  3.2 分析方法  35
    3.2.1 苦参毛状根诱导率统计  35
    3.2.2 苦参毛状根生物量的测定  35
    3.2.3 苦参毛状根中氧化苦参碱的含量测定  35
  3.3 研究内容与方法  35-36
    3.3.1 不同因素对苦参毛状根诱导率的影响  35-36
    3.3.2 苦参毛状根的鉴别  36
    3.3.3 苦参毛状根继代培养条件研究  36
  3.4 结果与分析  36-41
    3.4.1 不同因素对苦参毛状根诱导率的影响  36-38
    3.4.2 苦参毛状根的鉴别  38-39
    3.4.3 苦参毛状根继代培养条件研究  39-40
    3.4.4 苦参毛状根中苦参碱及氧化苦参碱的检测  40-41
  3.5 小结  41-42
4 苦参愈伤组织诱导与继代培养研究  42-49
  4.1 试验材料与仪器设备  42-43
    4.1.1 试验材料  42
    4.1.2 主要仪器及设备  42-43
  4.2 分析方法  43
    4.2.1 苦参愈伤组织生物量的测定  43
    4.2.2 愈伤组织中苦参碱和氧化苦参碱的定性分析  43
    4.2.4 愈伤组织中苦参碱和氧化苦参碱的定量分析  43
  4.3 研究内容与方法  43-44
    4.3.1 苦参愈伤组织诱导研究  43-44
    4.3.2 苦参愈伤组织增殖继代培养研究  44
  4.4 结果与分析  44-48
    4.4.1 苦参愈伤组织诱导研究  44-46
    4.4.2 愈伤组织的继代培养研究  46-47
    4.4.3 苦参愈伤组织中苦参碱和氧化苦参碱的含量检测  47-48
  4.5 小结  48-49
5 结论与展望  49-51
  5.1 结论  49
  5.2 展望  49-51
致谢  51-52
参考文献  52-57
附录 A：MS 培养基配方  57-58
附录 B：改良 1/2MS 培养基配方  58-59
攻读学位期间发表的学术论文目录  59-60

苦参毛状根及愈伤组织培养研究

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