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小菜蛾和甜菜夜蛾鱼尼丁受体基因克隆及分子药理学研究

作　者: 孙丽娜
导　师: 袁会珠
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农药学
关键词: 鱼尼丁受体小菜蛾甜菜夜蛾二酰胺类杀虫剂鱼尼丁受体表达量
分类号: S482.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

自氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺成功创制以来，作用于昆虫鱼尼丁受体（RyR）的化合物合成以及昆虫鱼尼丁受体基因克隆成为研究热点。两种杀虫剂对鳞翅目昆虫均具有较好的活性，然而具体的作用位点尚未明确。本文以小菜蛾幼虫和甜菜夜蛾脂肪体细胞为研究对象，利用RT-PCR克隆两种昆虫的RyR基因。并利用荧光定量PCR首次研究了二酰胺类杀虫剂对小菜蛾和甜菜夜蛾脂肪体细胞鱼尼丁受体基因表达量的差异。结论如下：1）本研究克隆了小菜蛾鱼尼丁受体（Px-RyR）基因cDNA全长，为15748bp，开放阅读框为15372bp，预测其可以编码5123个氨基酸，分子量为579.5kDa，等电点为5.45。通过对氨基酸二级结构分析，小菜蛾鱼尼丁受体基因，在C-末端存在6个跨膜区域，且存在一个成孔区域GVRAGGGIGD，在小菜蛾鱼尼丁受体基因的N-端存在RyR结构域，此序列出现四次重复，平均相似性为33%。小菜蛾RyR氨基酸序列与烟芽夜蛾和家蚕的相似性均为92%，与果蝇的相似性为78%，与脊椎动物鼠RyR1、RyR2、RyR3的相似性分别为45%、47%、46%。采用实时荧光定量PCR研究发现鱼尼丁、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺处理均使敏感小菜蛾3龄幼虫鱼尼丁受体表达量增大。且对氯虫苯甲酰胺产生16.8倍抗性的小菜蛾体内鱼尼丁受体mRNA表达量是敏感小菜蛾的5.79倍。而对照药剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和溴虫腈对小菜蛾幼虫鱼尼丁受体表达量均无影响。2）本研究也克隆了甜菜夜蛾脂肪体细胞鱼尼丁受体基因cDNA开放阅读框，为15357bp，预测其可以编码5118个氨基酸，分子量为578.7kDa，等电点为5.44。其余特性与小菜蛾均相似。本研究表明氯虫苯甲酰胺可以使甜菜夜蛾脂肪体细胞RyR表达量上调。随着氯虫苯甲酰胺浓度(0.1nM,1nM,10nM,1M,100M)的增大，在处理后24h Se-RyR表达量是逐渐增大的。而48h时连续处理，随着氯虫苯甲酰胺浓度的增大Se-RyR表达量也呈现逐渐增大的趋势。但是统计分析显示，在处理24h时，氯虫苯甲酰胺浓度对数于Se-RyR表达量呈线性正相关。综上所述，本研究通过对小菜蛾和甜菜夜蛾RyR基因的克隆以及二酰胺类杀虫剂对敏感小菜蛾和甜菜夜蛾脂肪体细胞RyR mRNA表达量影响的分析。本研究结论为进一步证明二酰胺类化合物的作用机制，并为作用于RyR靶标的新化合物的筛选以及对二酰胺类杀虫剂可能的抗性机制的研究奠定基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-15
第一章文献综述  15-31
  1.1 鱼尼丁受体研究进展  15-24
    1.1.1 鱼尼丁受体结构和功能  15-17
    1.1.2 鱼尼丁受体钙信号  17-18
    1.1.3 化合物对鱼尼丁受体功能的调节  18-19
    1.1.4 鱼尼丁受体与内源蛋白的相互作用  19-20
    1.1.5 昆虫鱼尼丁受体  20-21
    1.1.6 植物源杀虫剂—鱼尼丁和鱼尼丁碱  21-22
    1.1.7 作用于 RyR 的杀虫剂  22-24
  1.2 作用于昆虫鱼尼丁受体化合物的筛选研究进展  24-29
    1.2.1 昆虫活体筛选研究方法  24-25
    1.2.2 离体筛选研究方法  25-29
  1.3 本研究的目的与意义  29-31
第二章小菜蛾鱼尼丁受体基因克隆及序列分析  31-54
  2.1 试验材料  31
    2.1.1 小菜蛾的饲养  31
    2.1.2 主要试剂  31
    2.1.3 试剂配制  31
    2.1.4 主要仪器设备  31
  2.2 试验方法  31-41
    2.2.1 总 RNA 的提取  31-32
    2.2.2 引物设计  32-34
    2.2.3 反转录合成 cDNA 第一链  34-35
    2.2.4 PCR 扩增  35-39
    2.2.5 DNA 片段回收与纯化  39-40
    2.2.6 目的片段与载体连接  40
    2.2.7 转化  40
    2.2.8 重组质粒鉴定  40-41
    2.2.9 序列测定及分析  41
  2.3 结果与分析  41-51
    2.3.1 RNA 的提取  41-42
    2.3.2 简并引物 RT-PCR 结果  42-43
    2.3.3 简并引物与特异性引物结合 RT-PCR 结果  43-45
    2.3.4 特异性引物 RT-PCR 结果  45-46
    2.3.5 3'RACE 和 5'RACE 结果  46-48
    2.3.6 序列分析  48-51
  2.4 讨论  51-54
第三章氯虫苯甲酰胺对小菜蛾鱼尼丁受体基因 mRNA 表达量的影响  54-63
  3.1 材料及方法  54-56
    3.1.1 供试材料  54-55
    3.1.2 试验方法  55-56
    3.1.3 数据统计与分析  56
  3.2 结果与分析  56-61
    3.2.1 引物扩增效率与溶解曲线的测定  56-58
    3.2.2 供试 3 种杀虫剂对敏感种群小菜蛾生长及鱼尼丁受体基因表达量的影响  58-59
    3.2.3 氯虫苯甲酰胺连续处理和间断处理对敏感种群小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量变化的影响  59-60
    3.2.4 氯虫苯甲酰胺抗性种群与敏感种群小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量的差异  60-61
  3.3 讨论  61-63
第四章二酰胺类杀虫剂对小菜蛾鱼尼丁受体基因 mRNA 相对表达量的影响  63-71
  4.1 材料及方法  63-64
    4.1.1 供试材料  63
    4.1.2 试验方法  63-64
    4.1.3 数据统计与分析  64
  4.2 结果与分析  64-68
    4.2.1 四种杀虫剂对小菜蛾生长的影响  64-65
    4.2.2 普通 PCR，qRT-PCR 引物扩增效率的测定  65-66
    4.2.3 四种杀虫剂对小菜蛾幼虫鱼尼丁受体基因表达量的影响  66-68
  4.3 讨论  68-71
第五章甜菜夜蛾脂肪体细胞鱼尼丁受体基因克隆  71-81
  5.1 材料与方法  71-74
    5.1.1 细胞培养  71
    5.1.2 引物设计  71-73
    5.1.3 细胞总 RNA 提取  73
    5.1.4 cDNA 第一链的合成  73
    5.1.5 PCR 扩增目的片段  73-74
    5.1.6 cDNA3'末端快速扩增（3'RACE）  74
    5.1.7 PCR 产物或者纯化产物与载体连接  74
    5.1.8 大肠杆菌的载体转化与重组子筛选  74
    5.1.9 重组质粒鉴定  74
    5.1.10 目标片段序列测定与软件分析  74
  5.2 结果与分析  74-79
    5.2.1 总 RNA 提取  74-75
    5.2.2 反转录 PCR 扩增部分目的片段（RT-PCR）  75
    5.2.3 3'RACE 扩增 Se-RyR cDNA C-末端序列  75-76
    5.2.4 重组质粒的鉴定  76-77
    5.2.5 序列分析  77-79
  5.3 讨论  79-81
第六章氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾脂肪体细胞鱼尼丁受体 mRNA 表达量的影响  81-88
  6.1 材料与方法  81-83
    6.1.1 细胞培养  81
    6.1.2 供试药物  81
    6.1.3 主要试剂  81
    6.1.4 主要仪器  81
    6.1.5 试验步骤  81-83
    6.1.6 数据分析  83
  6.2 结果与分析  83-86
    6.2.1 引物扩增效率与溶解曲线的测定  83-84
    6.2.2 氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾脂肪体细胞鱼尼丁受体基因表达量的影响  84-86
  6.3 讨论  86-88
第七章全文结论  88-90
参考文献  90-99
附录一  99-109
附录二  109-119
致谢  119-120
作者简历  120

小菜蛾和甜菜夜蛾鱼尼丁受体基因克隆及分子药理学研究

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