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小菜蛾Bt抗性的AFLP标记研究
作 者: 魏娟
导 师: 肖铁光;张友军
学 校: 湖南农业大学
专 业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 小菜蛾 Cry1Ac AFLP 特异性基因片段
分类号: S476.12
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 37次
引 用: 1次
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内容摘要
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,在世界范围内得到广泛的应用。但目前转Bt基因农作物和Bt制剂的使用正面临着害虫对Bt抗药性的威胁。小菜蛾Plutella xylostella(L.)是十字花科蔬菜的重要害虫,也是最早发现的对Bt产生抗药性的田间种群,其抗药性仍在增长。本研究采用分子生物学技术,分别以美国敏感、美国抗性(以CrylAc毒蛋白进行选育)、国内田间采集(室内分别以CrylAc毒蛋白汰选及Bt制剂汰选)小菜蛾种群为材料,建立了有效的AFLP分子标记体系,筛选出Bt抗性小菜蛾种群中的特异性基因片段;运用基因克隆技术,对小菜蛾抗Bt毒素特异性基因片段进行了克隆和序列分析。主要结论如下:1.比较了小菜蛾饲养笼与小菜蛾饲养箱对饲养小菜蛾的差异,结果表明,用小菜蛾饲养笼饲养的小菜蛾种群产卵量高,发育更整齐。2.用CrylAc毒蛋白及Bt制剂分别对小菜蛾进行了室内抗性选育,获得对CrylAc毒蛋白抗性倍数为14.8和24.43的两个小菜蛾抗性种群-美国抗性种群和深圳抗性种群,以及对Bt制剂抗性倍数为74.47的小菜蛾上海抗性种群。3.利用AFLP技术对小菜蛾抗性与敏感种群对Bt毒素抗药性在基因上的差异进行研究。64对AFLP引物组合共扩增出2024条清晰的条带,平均每对引物可获得32条扩增条带。其中,11对引物能够在对Bt毒素抗性与敏感的小菜蛾种群间扩增出特异表达条带,特异表达检出率为8.79%。11对引物共扩增出32条特异表达条带。4.AFLP分子标记与PCR技术相结合,从银染后的PAGE胶上将特异性目的片段挖带回收,与pEASY-T载体连接,从三个抗性小菜蛾种群中共克隆出14条可能与Bt抗性相关的特异性基因片段。5.对其中的一条特异性基因片段设计特异性引物,经PCR扩增检测验证,可在所有的抗性种群中扩增出一条106bp的条带,而敏感种群没有,证明该片段小菜蛾对Bt产生抗药性相关,可用于小菜蛾对Bt抗性的早期检测。其它特异性基因片段是否与小菜蛾对Bt毒素产生抗药性相关,这些都有待于进一步的试验验证。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-8 目录 8-11 第一章 文献综述 11-24 1 昆虫抗药性的概念 11 2 小菜蛾抗药性的历史和现状 11-16 2.1 小菜蛾抗药性发展现状 12-14 2.2 小菜蛾对 Bt的抗性现状 14-16 3 小菜蛾抗药性的危害 16-17 3.1 危害农作物的生产 16 3.2 加剧农药污染问题 16-17 3.3 破坏对害虫的自然控制作用 17 4 昆虫抗药性的研究及监测技术 17-21 4.1 生物测定技术 17-18 4.2 生化检测技术 18 4.3 分子标记技术 18-20 4.4 基因芯片技术 20-21 5 论文设计 21-24 5.1 立论依据 21-22 5.2 研究的内容与方法 22 5.3 主要创新点 22 5.4 技术路线 22-24 第二章 小菜蛾室内饲养技术及抗性选育 24-32 1 材料和方法 24-27 1.1 实验材料 24-25 1.2 供试药剂 25 1.3 研究方法 25-27 2 结果和分析 27-30 2.1 成虫的饲养 27-28 2.2 幼虫期甘蓝苗饲养 28-29 2.3 小菜蛾对 Bt制剂的抗性选育 29-30 2.4 小菜峨对 Cry1Ac毒蛋白的抗性选育 30 3 小结与讨论 30-32 第三章 AFLP分子标记体系的建立及引物筛选 32-47 1 材料和方法 33-40 1.1 材料 33-34 1.2 实验方法 34-40 2 结果与分析 40-47 2.1 DNA的浓度与纯度 40-41 2.2 酶切连接及预扩增 41-42 2.3 选择性扩增 42 2.4 引物的选择 42-44 2.5 Bt抗性小菜蛾品系和敏感品系间特异性片段的AFLP分析 44-47 第四章 Bt抗性小菜蛾种群的特异性片段的回收、克隆与序列分析 47-81 1 材料和方法 47-54 1.1 实验材料 47-50 1.2 实验方法 50-54 2 结果与分析 54-80 2.1 特异性基因片段回收后 PCR扩增 54 2.2 PCR产物纯化回收后电泳图 54-55 2.3 特异性片段 PCR扩增产物的克隆及鉴定 55 2.4 核酸序列结果与分析 55-79 2.5 特异性基因片段的验证 79-80 3 小结与讨论 80-81 第五章 全文主要结论 81-82 参考文献 82-89 致谢 89-91 作者简介 91
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用 > 昆虫真菌
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