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土壤中毒死蜱降解质粒pDOC的转移及其促成的生物强化作用

作　者: 张群
导　师: 虞云龙
学　校: 浙江大学
专　业: 农药学
关键词: 毒死蜱 质粒转移 生物强化 绿色荧光蛋白(GFP)
分类号: S481.8
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


毒死蜱作为一种广谱、低毒、低残留、低抗药性和高效的有机磷杀虫剂,在我国被广泛应用,同时其在环境中的污染不容忽视。生物修复是治理毒死蜱污染的一种切实有效的方法。本实验室分离到一株以毒死蜱为唯一碳源和能源生长的细菌DSP,通过形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析将其鉴定为芽孢杆菌(Bacillus latersporus),并确定了其降解功能位于质粒pDOC。本文通过投加质粒pDOC到土壤进行生物修复,探索质粒pDOC在土壤中的转移机制及其在毒死蜱降解中的作用,以建立一种以质粒转移为基础的农药微生物降解生物强化新途径,从本质上提高土壤微生物对农药的降解能力,克服生物强化中面临的接种菌存活问题。主要研究结果如下：(1)利用菌株Bacillus latersporus DSP、E. coli DH5a (pZP201-gfp)及E. coli HB101(pRK2013)的抗性交叉差异行为进行三亲杂交构建荧光毒死蜱降解菌Bacillus latersporus DSP (pDOC-gfp)。通过荧光、降解功能及降解性质粒pDOC-gfp检测证明Bacillus latersporus DSP (pDOC-gfp)构建成功。(2)以杭州华家池桑树田土壤为材料,采用标记质粒pDOC-gfp投加到毒死蜱污染土壤进行生物修复,并从修复30d后的土壤中分离得到4个发荧光且对毒死蜱有降解能力的单菌,分别命名为ZQ1、ZQ2、ZQ3和ZQ4。通过形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列证明这4个菌株属于不同种的细菌,由此说明质粒pDOC-gfp在土壤中向土著微生物发生转移。(3)利用标记菌株Bacillus latersporus DSP (pDOC-gfp)研究了质粒pDOC强化十壤中毒死蜱降解作用的持久性及其对土壤微生物的影响。结果表明,随着施药频率的增加,降解菌对毒死蜱的生物强化效果长期有效；接种降解菌对土壤微生物群落功能多样性没有显著影响,不具破坏性。(4)利用标记菌株Bacillus latersporus DSP (pDOC-gfp)采用土柱淋滤的方法研究质粒pDOC在饱和流/非饱和流毒死蜱污染土壤中垂直迁移情况及其对毒死蜱降解。研究发现,质粒pDOC在土壤中可以向下发生迁移；同时质粒供体菌的迁移与质粒转移进入土著菌可以强化土壤中毒死蜱的降解作用。(5)研究质粒pDOC强化毒死蜱微生物降解的影响因子,结果表明：接种质粒供体菌明显促进了毒死蜱生物降解率,E. coli JM109(pDOC-gfp)是本实验条件中长期修复毒死蜱污染土壤的最佳选择；不同条件下E. coli JM109(pDOC-gfp)对毒死蜱的降解作用顺序为：10mg kg-1≈1mg kg-1>50mg kg-1>100mg kg-130℃>40℃>20℃、60%WHC (田间最大持水量)>40%WHC>80%HZ soil(杭州土壤)>JX soil (嘉兴土壤)>XS soil (萧山土壤)>JH soil(金华土壤)。

全文目录


致谢  7-13
摘要  13-15
abstract  15-18
第一章 文献综述  18-30
  1.1 农药微生物降解及其降解性质粒  18-21
    1.1.1 降解农药的微生物种类  18-19
    1.1.2 微生物降解农药的机理  19-20
    1.1.3 微生物降解性质粒  20-21
  1.2 基因水平转移  21-28
    1.2.1 基因水平转移  22-23
    1.2.2 基因水平转移的机理  23-24
    1.2.3 影响基因水平转移的因素  24-26
    1.2.4 基因水平转移与降解功能形成  26-27
    1.2.5 基于基因水平转移的污染修复  27-28
  1.3 本文研究目的和意义  28-30
第二章 质粒pDOC-gfp的构建  30-41
  2.1 引言  30
  2.2 材料和方法  30-35
    2.2.1 试验菌株  30-31
    2.2.2 主要试剂及仪器  31-32
    2.2.3 培养基  32
    2.2.4 试验菌株的抗药性  32-33
    2.2.5 质粒pDOC-gfp的构建  33
    2.2.6 荧光检测  33-34
    2.2.7 Bacillus latersporus DSP(pDOC-Ggfp)的降解性能  34-35
      2.2.7.1 Bacillus latersporus DSP(pDOC-gfp)的培养与收集  34
      2.2.7.2 Bacillus latersporus DSP(pDOC-gfp)对毒死蜱的降解  34-35
    2.2.8 质粒DNA琼脂糖电泳分析  35
  2.3 结果与讨论  35-40
    2.3.1 无机盐培养基中毒死蜱的添加回收率  35
    2.3.2 试验菌株对抗生素的抗性  35-38
    2.3.3 Bacillus latersporus DSP(pDOC-gfp)及其荧光检测  38-39
    2.3.4 Bacillus latersporus DSP(pDOC-gfp)对毒死蜱的降解  39-40
    2.3.5 Bacillus latersporus DSP(pDOC-gfp)质粒检测  40
  2.4 小结  40-41
第三章 质粒pDOC在土壤中的转移及其对毒死蜱降解的强化作用  41-58
  3.1 引言  41-42
  3.2 材料和方法  42-47
    3.2.1 试验菌株  42
    3.2.2 主要试剂及仪器  42
    3.2.3 培养基  42-43
    3.2.4 质粒pDOC对毒死蜱降解的强化作用  43-45
      3.2.4.1 供试土壤  43
      3.2.4.2 质粒pDOC-gfp的大量提取  43-45
      3.2.4.3 质粒pDOC对土壤中毒死蜱降解的强化作用  45
    3.2.5 质粒转移形成降解菌的分离与鉴定  45-46
    3.2.6 土壤中毒死蜱的提取及检测  46
    3.2.7 土壤中毒死蜱降解菌数量  46-47
    3.2.8 质粒转移的荧光检测  47
  3.3 结果与讨论  47-57
    3.3.1 土壤中毒死蜱的添加回收率  47-49
    3.3.2 质粒pDOC对毒死蜱降解的强化作用  49-57
      3.3.2.1 质粒pDOC-gfp处理土壤中对毒死蜱的降解  49-50
      3.3.2.2 质粒pDOC-gfp处理土壤毒死蜱降解菌数量  50
      3.3.2.3 质粒转移的荧光观察  50-53
      3.3.2.4 质粒转移形成的新降解菌  53-55
      附图表  55-57
  3.4 小结  57-58
第四章 质粒pDOC强化土壤中毒死蜱降解作用的持久性及其对土壤微生物的影响  58-73
  4.1 引言  58
  4.2 材料和方法  58-64
    4.2.1 试验材料  58-59
    4.2.2 供试土壤  59
    4.2.3 质粒pDOC供体菌的制备  59
    4.2.4 质粒pDOC强化土壤中毒死蜱降解作用的持久性试验  59
    4.2.5 土壤微生物功能多样性分析  59-60
    4.2.6 土壤呼吸活性分析  60
    4.2.7 质粒转移的荧光检测  60
    4.2.8 数据处理  60-64
  4.3 结果与讨论  64-71
    4.3.1 质粒pDOC强化土壤中毒死蜱降解作用的持久性  64-67
    4.3.2 质粒pDOC强化土壤中微生物功能多样性的变化  67-69
      4.3.2.1 质粒pDOC强化土壤中微生物群落碳源利用的变化  67-68
      4.3.2.2 质粒pDOC强化土壤中微生物群落多样性的变化  68-69
    4.3.3 质粒pDOC强化土壤中土壤呼吸活性的变化  69-71
  4.4 小结  71-73
第五章 质粒pDOC在土壤中的迁移及其对毒死蜱降解的强化作用  73-96
  5.1 引言  73
  5.2 材料和方法  73-76
    5.2.1 试验材料  73
    5.2.2 试验装置  73-75
    5.2.3 试验方法  75-76
      5.2.3.1 土壤样品  75
      5.2.3.2 试验过程  75
      5.2.3.3 土壤中毒死蜱的提取方法  75-76
      5.2.3.4 土壤中毒死蜱降解菌的数量  76
      5.2.3.5 质粒转移的荧光检测  76
    5.2.4 统计分析  76
  5.3 结果与讨论  76-95
    5.3.1 土壤中毒死蜱的添加回收率  76-79
    5.3.2 饱和土壤中质粒pDOC的迁移及其对毒死蜱降解  79-87
    5.3.3 非饱和土壤中质粒pDOC的迁移及其对毒死蜱降解  87-89
    附图表  89-95
  5.4 小结  95-96
第六章 质粒pDOC强化毒死蜱降解的影响因子  96-128
  6.1 引言  96
  6.2 材料和方法  96-101
    6.2.1 试验材料  96
    6.2.2 试验方法  96-101
      6.2.2.1 土壤样品  96-99
      6.2.2.2 pDOC供体菌的构建  99
      6.2.2.3 质粒供体菌与毒死蜱降解  99-100
      6.2.2.4 浓度对pDOC强化毒死蜱降解的影响  100
      6.2.2.5 温度对pDOC强化毒死蜱降解的影响  100
      6.2.2.6 湿度对pDOC强化毒死蜱降解的影响  100
      6.2.2.7 土壤类型对pDOC强化毒死蜱降解的影响  100
      6.2.2.8 金华、嘉兴、萧山土壤中毒死蜱的提取及检测  100
      6.2.2.9 土壤中毒死蜱降解菌的数量  100-101
      6.2.2.10 质粒转移的荧光检测  101
  6.3 结果与讨论  101-127
    6.3.1 金华、嘉兴、萧山土壤中毒死蜱的添加回收率  101
    6.3.2 gfp标记供体菌的构建  101-106
      6.3.2.1 土著菌的筛选与鉴定  101-102
      6.3.2.2 gfp标记供体菌的荧光检测  102-103
      6.3.2.3 gfp标记供体菌对毒死蜱的降解  103-104
      6.3.2.4 gfp标记供体菌的质粒检测  104-106
    6.3.3 不同pDOC供体菌对毒死蜱降解的强化效应  106-109
    6.3.4 浓度对pDOC强化毒死蜱降解的影响  109-114
    6.3.5 温度对pDOC强化毒死蜱降解的影响  114-117
    6.3.6 湿度对pDOC强化毒死蜱降解的影响  117-121
    6.3.7 土壤类型对pDOC强化毒死蜱降解的影响  121-123
    附图表  123-127
  6.4 小结  127-128
第七章 结论  128-131
参考文献  131-145
附录  145-149

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 植物化学保护理论 > 农药残毒
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