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热处理结合化学处理脱除梨病毒研究及热处理植株中病毒siRNAs鉴定

作　者: 胡国君
导　师: 王国平; 洪霓
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理
关键词: 砂梨苹果茎沟病毒苹果褪绿叶斑病毒基因组测序 SSCP 群体结构热处理化学处理 siRNA
分类号: S436.612
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

病毒危害可严重影响梨生长势和降低果品产量与品质,栽培无病毒种苗是减轻梨病毒病危害的重要途径,热处理和化学处理是获得无病毒果树种质的主要方法。大量的研究表明持续高温或采用一定浓度的病毒抑制剂处理可以脱除植物病毒,但梨对高温相对敏感,长时间的高温处理易造成梨植株的大量死亡,化学处理也可导致梨植株产生药害,同时需要较长的处理周期。本研究以感染有苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)的砂梨“金水2号”离体植株为试验材料,采用热处理(35°C)与化学处理(病毒醚)相结合的方法进行梨病毒脱除的研究,以期提高病毒脱除效果。同时对继代培养过程中梨离体植株的ASGV分子群体结构特点进行了系统分析,测定了一个ASGV砂梨分离物的全长基因组序列。并以热处理的砂梨离体植株为材料,采用高通量测序方法分析了该植株中ASGV的siRNA组成特点,定量分析了其在热处理35d过程中的含量变化。结果如下：1.以砂梨“黄花”离体植株为研究材料,采用RT-PCR技术对ASGV进行检测的结果表明,该病毒在20次继代培养的“黄花”离体植株中可以稳定增殖。对扩增产物进行克隆,每次继代的植株中挑选大于20个克隆的单链构象多态性(SSCP)分析的结果显示,“黄花”离体植株中存在ASGV的一个优势分子变种,继代培养对ASGV的分子群体结构没有明显影响。2.根据GenBank登录序列设计合成引物,对来源于砂梨“黄花”离体植株的ASGV的全基因组进行了扩增和序列分析,该分离物的全基因组(除去聚合A尾)由6496个核苷酸组成(命名为ASGV-HH),包含两个开放阅读框(ORF),分别编码241kDa聚合蛋白和36kDa运动蛋白。全基因组序列与已报道的来源于日本的苹果分离物ASGV-P-209,日本的百合分离物CTLV-L和CTLV-Li-23,韩国的砂梨分离物ASGV-P,台湾的柑橘分离物CTLV-K和CTLV-LCd-NA-1,以及美国的柑橘分离物CTLV-ML的相似性为79.8-87.1%,其中,ASGV-HH的复制酶编码区序列与日本的苹果分离物ASGV-P-209(?)似性最高,核苷酸和氨基酸现相似性分别为86.2%和89.9%,其CP和MP的核苷酸序列则与来源于日本的百合分离物CTLV-L同源性最高,分别为93.7%和87.6%。根据该病毒的可变区Ⅱ的氨基酸序列构建系统进化树显示,ASGV-HH与CTLV-L亲缘关系最近,而与来源于韩国的梨分离物ASGV-P亲缘关系较远。3.以感染ASGV和ACLSV的砂梨“金水2号”离体植株为研究材料,比较分析了热处理(35℃)、化学处理(病毒醚)及二者相结合对梨离体植株生长的影响及脱除这两种病毒的效果,结果显示15-25μg/ml病毒醚处理5-30d对梨离体植株的生长和增殖有明显的促进作用,株高由未处理植株的2.10cm增加至2.57-2.61cm,增殖系数由未处理植株的3.27增加至4.09-8.82。分别于处理30d、35d和40d切取0.5mm和1mm的茎尖进行培养,继代1-2次后采用RT-PCR的方法对再生植株的带毒情况进行检测,结果表明化学处理与热处理相结合可明显提高病毒脱除效果,采用15μg/mL和20μg/mL病毒醚结合35℃处理40d所获再生植株的ACLSV和ASGV脱除率分别由病毒醚单独处理的50.0-60.0%和41.7-50.0%提高至61.5-69.2%和53.8-76.9%,采用25μg/mL病毒醚结合35℃处理40d后切取的0.5-1.0mm茎尖所获再生植株的病毒脱除率达100%。采用该方法对“圆黄梨”、“黄花梨”、“雪花梨”和苹果“潮南”离体植株进行了处理,脱病毒率“圆黄梨”和苹果的为100.0%,“黄花梨”和“雪花梨”的分别为84.6%和64.8%。4.采用高通量测序方法对经热处理的砂梨“黄花”离体植株中小分子RNA进行了鉴定,共测得16,372,275种,其中与ASGV-HH序列匹配的siRNA有3111种(简称vsiRNA),这些vsiRNA的大小在18-25nt,21nt和22nt所占比例最大,占总数的82.7%。各vsiRNA的出现频率为1-103次。vsiRNA在ASGV-HH基因组的正负链上的分布有一定的偏向性,在正链上分布频率较高,为55.8%。根据vsiRNA所对应ASGV-HH基因组序列,选取与ASGV基因组6个保守结构域的对应的6个vsiRNAs,采用定量RT-PCR (qRT-PCR)分析其在热处理梨植株中相对含量的时间动态变化,结果表明各vsiRNA的含量在热处理初期呈明显下降趋势,而至25d时均出现一个峰值。其中,对应Met、Het、P-Pro和MP的vsiRNA在热处理25d植株中的含量较处理前的植株低,而对应CP和Rdrp的vsiRNA在热处理25d植株中的含量明显高于处理前的植株,分别为处理前的1.3和2.5倍。ASGV的含量随热处理时间的延长呈明显的下降趋势,第5d即开始减低,至第25d时病毒RT-PCR产物的扩增条带已经极其微弱,推测高温促进了病毒RNA沉默的发生。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩略词表  13-16
第一章前言  16-34
  1 梨的主要病毒及其危害特点  16-19
    1.1 苹果花叶病毒(ApMV)  16-17
    1.2 苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)  17-18
    1.3 苹果茎沟病毒(ASGV)  18
    1.4 苹果茎痘病毒(ASPV)  18-19
  2 ASGV的分子特性  19-21
    2.1 ASGV的基因组结构  19-20
    2.2 ASGV的分子变异  20-21
  3 植物病毒脱除技术途径  21-28
    3.1 热处理脱除病毒方法  22-23
    3.2 茎尖培养脱除病毒方法  23-24
    3.3 化学处理脱除病毒方法  24-26
    3.4 热处理结合化学处理脱除病毒方法  26
    3.5 病毒脱除方法在梨上的应用  26-28
  4 温度对siRNA积累的影响  28-33
    4.1 siRNA的特点  28-30
    4.2 热处理脱除病毒机理  30-31
    4.3 温度对病毒vsiRNA特性的影响  31-33
  5 研究目的和意义  33-34
第二章梨离体植株继代培养对ASGV群体结构的影响  34-47
  1 研究材料  34-35
    1.1 供试植物材料  34
    1.2 主要试剂  34-35
  2 研究方法  35-39
    2.1 样品的收集  35
      2.1.1 茎尖的分离培养  35
      2.1.2 离体植株样品的收集  35
    2.2 目标片段的克隆与SSCP分析  35-39
      2.2.1 总RNA的提取  35-36
      2.2.2 cDNA的合成  36
      2.2.3 PCR扩增  36
      2.2.4 目标片段的回收  36-37
      2.2.5 连接  37
      2.2.6 热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞  37-38
      2.2.7 阳性克隆筛选  38
      2.2.8 PCR扩增中rTap DNA聚合酶错配率的计算  38
      2.2.9 SSCP  38-39
  3 结果与分析  39-45
    3.1 梨活体植株中ASGV组成的SSCP分析结果  39-40
    3.2 继代培养中离体植株的病毒检测  40
    3.3 继代培养中病毒群体的分布特性  40-43
    3.4 继代培养植株中ASGV变异观察  43-45
  4 讨论  45-47
第三章 ASGV砂梨分离物全基因组序列测定  47-63
  1 研究材料  47-50
    1.1 供试植物材料  47
    1.2 主要试剂  47
    1.3 所用引物  47-50
  2 研究方法  50-56
    2.1 总RNA的提取  50
    2.2 cDNA的合成  50
    2.3 PCR扩增  50
    2.4 3’RACE  50-51
      2.4.1 反转录  50
      2.4.2 巢式PCR扩增  50-51
    2.5 5’RACE  51-55
      2.5.1 去磷酸化处理  51-52
      2.5.2 “去帽子”  52-53
      2.5.3 5’RACE Adaptor的连接  53-54
      2.5.4 反转录  54
      2.5.5 巢式PCR扩增  54-55
    2.6 目标片段的克隆  55-56
      2.6.1 目标片段的回收与纯化  55
      2.6.2 连接  55
      2.6.3 热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞  55
      2.6.4 阳性克隆的筛选  55-56
  3 结果与分析  56-61
    3.1 ASGV基因组结构  56-57
    3.2 ASGV全基因组及各阅读框的序列特点  57-61
  4 讨论  61-63
第四章热处理与化学处理结合脱除梨病毒的研究  63-77
  1 研究材料  63
    1.1 待处理材料  63
    1.2 基本培养基配方  63
    1.3 主要试剂  63
  2 研究方法  63-66
    2.1 供试培养基的配制  63-64
      2.1.1 病毒醚母液的配置  63-64
      2.1.2 MS培养基的配置  64
      2.1.3 含病毒醚的MS培养基的配置  64
    2.2 离体植株的继代培养  64
    2.3 脱毒处理方法  64-65
      2.3.1 化学处理  64
      2.3.2 热处理  64-65
      2.3.3 热处理结合化学处理  65
      2.3.4 对照的设置  65
      2.3.5 培养条件及数据的记录  65
    2.4 病毒检测  65-66
      2.4.1 总RNA的提取  65
      2.4.2 cDNA的合成  65-66
      2.4.3 PCR扩增  66
  3 结果与分析  66-75
    3.1 不同处理对梨离体植株生长表型的影响  66-68
    3.2 不同处理对梨离体植株株高和增殖的影响  68-70
    3.3 不同处理的脱毒效果  70-75
  4 讨论  75-77
第五章热处理植株中ASGV产生的小分子RNAS鉴定  77-93
  1 研究材料  77-78
    1.1 供试植物材料  77
    1.2 主要试剂  77-78
    1.3 所用引物  78
  2 研究方法  78-82
    2.1 总RNA的提取  78-79
    2.2 Dnase的消化  79
    2.3 RT-PCR扩增  79-80
    2.4 Real-Time RT-PCR扩增  80-81
      2.4.1 病毒产生的siRNA的Real-Time RT-PCR扩增  80-81
      2.4.2 病毒的Real-Time RT-PCR扩增  81
    2.5 离体植株材料的获得  81-82
      2.5.1 离体植株的培养  81
      2.5.2 材料的收集  81-82
    2.6 离体植株的热处理  82
    2.7 热处理材料中siRNA的高通量测序  82
  3 结果与分析  82-90
    3.1 离体植株不同部位的病毒含量  82-83
    3.2 热处理不同时期病毒含量的变化  83
    3.3 测序样品的总RNA质量检测  83-85
      3.3.1 总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析  83-84
      3.3.2 样品总RNA的Agilent 2100检测  84-85
    3.4 热处理样品中ASGV产生的siRNA的特性  85-88
      3.4.1 vsiRNA的数量  85
      3.4.2 vsiRNA的片段大小及偏向性  85-86
      3.4.3 vsiRNA出现的频率及在基因组上的分布  86-88
    3.5 热处理不同时期ASGV与其siRNA的含量变化  88-90
      3.5.1 热处理不同时期离体材料中ASGV的含量变化  88
      3.5.2 热处理不同时期ASGV产生的siRNA的含量变化  88-90
  4 讨论  90-93
参考文献  93-111
附录A 常用溶液配方  111-113
附录B ASGV-HH全基因组序列  113-117
附录C 研究生期间发表文章  117-118
致谢  118-119

热处理结合化学处理脱除梨病毒研究及热处理植株中病毒siRNAs鉴定

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