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海南黄灯笼辣椒病毒病病原学及RNAi防控策略研究

作　者: 王健华
导　师: 刘志昕
学　校: 海南大学
专　业: 分子植物病理学
关键词: 黄灯笼辣椒病毒病辣椒环斑病毒 RNA干扰防控
分类号: S436.418.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

黄灯笼辣椒(Capsicum chinense),又称黄帝椒、黄辣椒,是颇具海南特色的辣椒种类,其味辣,世界闻名。黄灯笼辣椒酱已成为海南除椰子以外的另一个不可代替的旅游产品。随着黄灯笼辣椒种植面积的迅速扩大,许多问题陆续严重起来,特别是病毒危害的问题。黄灯笼辣椒比其它辣椒品种更容易感染植物病毒,其病害的发病率和严重度较高,常引起减产、失收。病毒病已成为影响黄灯笼辣椒种植业的最主要的毁灭性因素。相比于黄灯笼辣椒种植面积的迅速发展,黄灯笼辣椒病毒的防治及相关科研工作显得滞后。目前对病原病毒种类、症状识别、抗性利用等一些科研问题,一直关注不够,认识很少,这极大限制了黄灯笼辣椒产业的规模化发展。本文对海南黄灯笼辣椒病毒病进行了较全面的研究,首次系统研究了海南黄灯笼辣椒病毒病的病原学,探索了新的防控策略。通过田间调查,查明海南黄灯笼辣椒病毒病主要随着寄主的分布在海南东部沿海为害。其症状主要有花叶畸形、顶叶枯死、黄化、矮缩等4种类型。并以花叶畸形为主要类型,占62.5%。花叶畸形又可分为轻微斑驳、叶脉绿带、扭曲畸形等症状,矮缩则包括了植株成簇、矮缩蚀纹等症状。调查发现,高温季节发病极显著严重于气温凉爽季节；遮荫、覆盖地膜的种植方式病情指数极显著低于无遮荫、无地膜的处理；桶栽和地栽之间的病情无显著性差异,桶栽种植方式对防治病毒病没有实际帮助。对黄灯笼辣椒病毒病主要症状样品进行了包括病原病毒鉴定和病毒检测在内的病原学研究。通过病毒粒子形态观察、蛋白质谱分析、核酸分子鉴定等技术手段,对来自黄灯笼辣椒叶脉绿带、畸形扭曲、矮缩蚀纹症状样品中的3个病毒分离物进行了鉴定。首次鉴定和报道了辣椒环斑病毒((Zhilli ring spot virus, ChiRSV)在中国的存在。该分离物病毒粒子线状,弯曲,约12～13nm×750nm;黄灯笼辣椒被该分离物侵染后,病变叶肉细胞中发现存在大量风轮状内含体；用SDS-PAGE方法对该分离物的精提纯样品进行蛋白分离,并对目的蛋白进行质谱分析鉴定。结果表明,目的蛋白与ChiRSV的Polyprotein多肽高度匹配,最接近的病毒蛋白ID是ABL09414.1,为来自于越南的ChiRSV-VN/C9分离物。该鉴定的可信度得分572分,远高于阈值的71分,覆盖率35.38%；从病毒提纯物中提取病毒RNA,运用RT-PCR,获得一条611bp的条带,Blast结果表明,该条带与来自越南的ChiRSV-VN/C9和VN/C8分离物(DQ925439和DQ925438)的同源性最高,分别达92%和90%。在此基础上,对该病毒分离进行了全基因组测序。用该分离物全基因组序列(JN008909)与Potyvirus病毒属内其它病毒进行聚类比对分析发现,它与TVbMV的亲缘关系最近,但二者间全基因组的核苷酸同源性也仅为64.8%,CP蛋白氨基酸同源性为79.7%,均未达到分别为85%和80%的种的标准。根据以上实验结果,鉴定了该分离物的ChiRSV身份,并确认归属Potyvirus。这是ChiRSV在中国发生为害的首次报道。运用相同方法,还分别从叶脉绿带症状和矮缩蚀纹症状的黄灯笼辣椒上分离鉴定了辣椒脉斑病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV),前者亦归属Potyvirus,后者归属于Cucumovirus。针对以上病原病毒,着重研究建立了ChiRSV的检测方法。首先通过利用纯化病毒免疫家兔的方式,首次公开报道研制出ChiRSV多克隆抗血清,效价达1:125000,在此基础上建立了ChiRSV的间接ELISA (ID-ELISA)检测方法。其次,针对ChiRSV建立了RT-PCR分子检测方法,最低可检出12.5pg病毒RNA,相当于可从250ng病样组织中检测到病毒。利用所建立的检测手段,对海南黄灯笼辣椒田间样品进行随机抽检,结果表明,海南黄灯笼辣椒的病原病毒主要有ChiRSV、CMV、ChiVMV、TMV等,其中ChiRSV的检出率最高,达62%,主要分布在海南岛北部；CMV检出率59%,在海南岛各地均有分布；ChiVMV检出率27%,主要分布在海南岛南部。以上病原病毒的复合侵染现象普遍,占发病样品的48.6%。CMV在所有复合侵染病样中均可被检出,推测其可能在复合侵染中扮演重要角色。CMV与TMV的复合侵染导致了顶叶枯死症状的发生,CMV与Potyvirus病毒(ChiRSV或ChiVMV)复合侵染引起严重的花叶畸形症状。CMV单独侵染可引起矮缩蚀纹症状,ChiRSV和ChiVMV单独侵染或复合侵染,均可出现叶脉绿带症状,但二者的复合侵染症状更严重。检测还发现黄灯笼辣椒种子上可以传带CMV和TMV,ChiVMV与ChiRSV均不能由种子传播。运用RNAi相关的理论和技术,提出了应用细菌介导的dsRNA来防治黄灯笼辣椒病毒病的策略,并针对ChiRSV的HC-Pro、CP、PIPO等基因片段,构建了相应的dsRNA细菌表达载体。初步防治实验表明,处理组(目标基因片段的dsRNA或细菌破碎液)比对照组(清水、空载体、空菌)的症状出现较迟、病害严重度较轻。研究构建的dsRNA表达载体和成功提取的dsRNA,为利用dsRNA沉默病毒这一全新防治策略的实施打下基础。在上述研究的基础上,总结提出了包括种子消毒、盖膜遮阳等9项技术要点的综合防治技术,并已在生产中推广应用。目前,覆盖地膜已成为海南农户种植黄灯笼辣椒的基本措施,一些农户根据建议已放弃了桶栽模式,降低了生产成本。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-10
目录  10-13
1 序言  13-31
  1.1 海南黄灯笼辣椒生产现状及存在的主要问题  13-14
  1.2 国内外辣椒病毒病研究概况  14-17
  1.3 植物病毒复合侵染及其病原病毒的相互作用方式  17-19
    1.3.1 植物病毒的复合侵染  17
    1.3.2 复合侵染中病毒的相互作用方式  17-19
  1.4 植物病毒检测及鉴定技术评述  19-21
  1.5 Potyvirus病毒及其变异进化  21-25
    1.5.1 Potyvirus病毒基因组及基因功能研究进展  21-22
    1.5.2 Potyvirus病毒的变异和分类  22-23
    1.5.3 辣椒脉斑驳病毒  23-25
  1.6 黄瓜花叶病毒的危害及其变异进化  25-27
  1.7 植物病毒病防治研究现状与进展  27-31
2 研究内容和技术路线  31-33
  2.1 研究内容  31-32
  2.2 技术路线  32-33
3 材料与方法  33-55
  3.1 材料  33-35
    3.1.1 毒源样品  33-34
    3.1.2 试剂  34-35
    3.1.3 仪器设备  35
  3.2 方法  35-55
    3.2.1 田间调查  35-37
    3.2.2 海南黄灯笼辣椒病毒病的病原鉴定  37-45
      3.2.2.1 样品  37
      3.2.2.2 病毒粒子电镜观察  37-38
      3.2.2.3 病毒外壳蛋白的SDS-PAGE分析  38-39
      3.2.2.4 病毒外壳蛋白的质谱分析鉴定  39
      3.2.2.5 基于病毒核酸测序的分子鉴定  39-45
    3.2.3 ChiRSV检测方法的建立及应用  45-49
      3.2.3.1 ChiRSV多克隆抗体的制备及ID-ELISA检测方法的建立  45-47
      3.2.3.2 ChiRSV RT-PCR检测方法的建立  47-49
    3.2.4 海南黄灯笼辣椒田间样品病毒种类的随机检测  49
    3.2.5 基于RNAi沉默技术的dsRNA防控ChiRSV的探索  49-55
      3.2.5.1 dsRNA细菌表达载体的构建  49-53
      3.2.5.2 dsRNA细菌表达载体的诱导表达  53
      3.2.5.3 dsRNA的提取  53-54
      3.2.5.4 dsRNA重组细菌的超声波破碎  54
      3.2.5.5 dsRNA及重组细菌碎液干扰ChiRSV侵染的初步试验  54-55
4 结果与分析  55-86
  4.1 黄灯笼辣椒病毒病的田间调查  55-58
    4.1.1 海南黄灯笼辣椒病毒病的症状类型  55-56
    4.1.2 海南黄灯笼辣椒病毒病的发病条件  56-58
  4.2 病原病毒鉴定结果  58-74
    4.2.1 叶脉绿带症状黄灯笼辣椒(YZ样品)的鉴定  58-65
      4.2.1.1 YZ样品病毒形态学鉴定  58
      4.2.1.2 YZ样品病毒分离物外壳蛋白SDS-PAGE的分离  58-59
      4.2.1.3 YZ样品质谱分析鉴定  59-62
      4.2.1.4 YZ样品基于病毒核酸测序的分子鉴定  62
      4.2.1.5 YZ样品病毒分离物的鉴定结论  62-65
    4.2.2 畸形扭曲症状黄灯笼辣椒(WC样品)的鉴定  65-71
      4.2.2.1 WC样品形态学鉴定  65
      4.2.2.2 WC样品病毒分离物外壳蛋白SDS-PAGE的分离  65-66
      4.2.2.3 WC样品质谱分析鉴定  66-69
      4.2.2.4 WC样品基于病毒核酸测序的分子鉴定  69
      4.2.2.5 WC样品的鉴定结论  69-71
    4.2.3 蚀纹症状黄灯笼辣椒(CS样品)的鉴定  71-74
      4.2.3.1 CS样品病毒形态学鉴定  71
      4.2.3.2 CS样品基于病毒核酸测序的分子鉴定  71-74
      4.2.3.3 CS样品的鉴定结论  74
  4.3 黄灯笼辣椒病原病毒检测方法的建立及应用  74-80
    4.3.1 ChiRSV多克隆抗体的制备和ID-ELISA检测方法的建立  74-76
    4.3.2 ChiRSV RT-PCR检测方法的建立  76-79
      4.3.2.1 引物筛选和PCR反应体系和程序  76-77
      4.3.2.2 ChiRSV的RT-PCR检测灵敏度测定  77-78
      4.3.2.3 ChiRSV的RT-PCR检测方法的应用  78-79
    4.3.3 海南黄灯笼辣椒田间样品的抽样检测结果及分析  79-80
  4.4 基于RNAi沉默的dsRNA防控ChiRSV探索  80-85
    4.4.1 dsRNA细菌表达载体的构建  80-83
    4.4.2 重组菌的诱导培养和dsRNA的提取  83-84
    4.4.3 dsRNA及其细菌破碎液阻止ChiRSV侵染的初步效果  84-85
  4.5 综合防治技术要点  85-86
5 讨论  86-93
  5.1 黄灯笼辣椒病毒病的病毒种类十分复杂  86-90
  5.2 利用dsRNA阻止病毒侵染的实际作用及讨论  90-91
  5.3 质谱辅助分析在植物病毒鉴定中的作用  91-93
6 结论  93-94
参考文献  94-104
攻读博士期间发表的相关论文  104-105
攻读博士期间承担的科研任务及获得的成果  105-106
致谢  106

海南黄灯笼辣椒病毒病病原学及RNAi防控策略研究

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