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缺氧诱导因子-1α的siRNA抑制肝癌细胞生长的实验研究

作 者: 胡迎春
导 师: 王成友;陈斌
学 校: 广州医学院
专 业: 外科学
关键词: 缺氧诱导因子-1α 基因重组 载体构建 原发性肝癌 RNA干扰 基因治疗
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 17次
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内容摘要


原发性肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,因其起病隐匿,发现时已多属晚期。目前HCC治疗手段有限,手术切除率低,术后复发率高。基因治疗作为一种新癌症的治疗手段,已成为医学研究的方向,其中新兴的RNA干扰(RNAi)技术在基因治疗方面具有较好应用前景。然而,RNAi处于基础实验研究阶段,分子机制目前尚未完全清晰,也未形成一套特异、高效的治疗体系。本实验拟通过实验方法找到针对肝癌细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的有特异干扰作用的siRNA序列和一套合适有效的RNA干扰策略。为以后进一步实验研究以及基因治疗药物研发提供理论依据。第一部分: HIF-1α靶向siRNA重组表达载体的构建目的:利用基因重组技术构建四组HIF-1α靶向siRNA重组表达载体,为后续实验研究提供试验基础。方法:利用网络资源并按要求设计出四条目的siRNAs并各自插入到载体质粒pGenesil-1.1中分别为:siRNA1(S1)、siRNA2(S2)、siRNA阴性(SN)、siRNA空白(SB)。经细菌筛选、扩增后运用酶切和基因测序技术检验重组序列是否符合设计要求。结果:质粒经酶切后两条片段大小均符合设计要求;四个质经粒基因测序验证基因序列完全正确。结论: HIF-1α靶向siRNA重组表达载体的构建成功。第二部分: HIF-1α的siRNA重组质粒抑制肝癌细胞的生长目的:筛选出对肝癌HIF-1α有干扰效果的siRNA序列,为后续实验研究以及基因药物研究提供实验基础。方法:四组重组载体经脂质体Lipofectamine 2000包埋后转染到缺氧环境的肝癌细胞株bel-7402中。运用RT-PCR检测HIF-1α转录水平以及细胞计数观察肝癌细胞生长受抑制情况。结果:其中S2组质粒能抑制目的基因HIF-1α的转录,S1、SN、均不能抑制HIF-1α的mRNA转录;其中转染S2组质粒的肝癌细胞生长明显受到抑制,而S1、SN与空白组相比未见肝癌细胞生长受抑制。结论:本实验筛选出一条特异的siRNA序列(即S2组),该序列的重组载体具有良好的转染效率,其转录产物能成功抑制靶向基因HIF-1α的转录,并抑制了该组肝癌细胞株bel-7402的生长,而S1、SN组均未能有效抑制目的基因的转录,肝癌细胞的生长也未受到抑制。

全文目录


中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
中英文缩写对照表  8-9
前言  9-11
第一部分 HIF-1α靶向siRNA 重组表达载体的构建和鉴定  11-22
  材料与方法  11-18
  结果  18-19
  讨论  19-21
  结论  21-22
第二部分 HIF-1α的siRNA 序列抑制肝癌细胞株bel-7402 的生长  22-33
  材料与方法  22-28
  结果  28-30
  讨论  30-32
  结论  32-33
参考文献  33-35
附图  35-40
综述  40-52
  参考文献  47-52
附录  52-53
致谢  53-55

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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