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棉花抗黄萎病相关基因类Pr10的分离及功能分析

作　者: 梁杉
导　师: 蒋继志; 曲占良
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大丽轮枝菌负调控系统获得性抗性类PR10
分类号: S435.621
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 36次
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内容摘要

棉花是我国重要的经济作物,黄萎病已成为严重影响棉花产量与棉纤维品质的重要的真菌性病害。目前国内外在黄萎病防治以及抗病育种方面尚未取得显著进展。本研究分离并鉴定了一个与棉花黄萎病抗性相关的基因,为进一步阐明棉花黄萎病抗性的分子机制以及利用基因工程手段进行抗黄萎病棉花育种提供更多的实验依据和基因资源。本实验室利用以黄萎病耐性陆地棉栽培品种BD18为实验材料构建了受大丽轮枝菌侵染诱导表达的cDNA减法文库,通过Reverse northern筛选获得了62个受大丽轮枝菌侵染诱导表达和15个受大丽轮枝菌侵染抑制的cDNA片段。在此基础上,本研究通过Northern blot对77个基因中的部分基因进行表达分析并结合前人研究结果分离到一个受大丽轮枝菌侵染抑制表达的类PR10基因。研究发现该基因编码一个158个氨基酸的棉花类PR10蛋白多肽,细胞定位实验发现该蛋白主要定位于细胞核内和细胞膜上。外源的植物抗病反应相关信号分子SA、ABA可以抑制该基因表达,而JA对该基因的表达具有诱导作用。进一步将该基因构建到植物表达载体并转化到烟草中,分析发现高表达类PR10的转基因株系能够抑制系统获得性抗性(SAR)途径中关键基因NPR1及其它一些抗性标记基因的表达；此外,通过对该基因编码的融合蛋白生化活性分析发现其在体外具有RNase活性,而这种酶活性可能与类PR10蛋白在核内经过修饰后特异性的降解RNA,从而调控基因转录有关,也可能和植物抗病毒病有关。综上所述,棉花类PR10基因在由大丽轮枝菌侵染所引起的获得性抗性反应(SAR)中可能起着负调控作用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
一引言  10-20
  1.1 棉花黄萎病  10-12
    1.1.1 概述  10
    1.1.2 大丽轮枝菌及其致病机理  10-11
    1.1.3 棉花抗黄萎病研究进展  11-12
  1.2 植物抗病的分子机制  12-17
    1.2.1 PAMPs及其引发的免疫反应  12-13
    1.2.2 病原菌对PTI的抑制  13-15
    1.2.3 效应因子激发的植物防卫反应(ETI)及抗性蛋白  15-16
    1.2.4 病原菌对ETI的适应  16-17
    1.2.5 植物的诱导系统性抗性  17
  1.3 PR10蛋白  17-19
  1.4 本研究的目的及意义  19-20
二材料与方法  20-28
  2.1 实验材料  20
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 菌株和载体  20
    2.1.3 常用分子生物学试剂  20
  2.2 实验方法  20-28
    2.2.1 大丽轮枝菌与接种试验  20-21
    2.2.2 棉花幼苗的胁迫和激素处理  21
    2.2.3 棉花总RNA的提取  21
    2.2.4 处理样品的转录水平分析  21-22
    2.2.5 对预选SSH文库中的候选基因片段进行Northern blot分析  22-23
    2.2.6 转烟草类PR10-pPZP111载体的构建  23-24
    2.2.7 pET28a(+)-PR10-like融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备  24
    2.2.8 PR10-like-GFP的亚细胞定位  24-25
    2.2.9 农杆菌介导的烟草转化  25-26
    2.2.10 类PR10蛋白RNase活性的检测  26
    2.2.11 高表达转基因烟草中其它抗性基因的分析  26-27
    2.2.12 本实验所用到的引物  27-28
三结果与分析  28-42
  3.1 棉花处理样品总RNA的提取  28
  3.2 棉花受大丽轮枝菌侵染后候选基因转录水平的分析  28-29
  3.3 棉花受大丽轮枝菌侵染后178号克隆(类PR10基因)特异性应答分析  29-31
  3.4 类PR10基因的分离  31
  3.5 类PR10基因的组织特异性分析  31-32
  3.6 类PR10基因对激素类信号分子及干旱胁迫的特异性应答  32-33
  3.7 类PR10蛋白的原核表达和体外活性检测  33-36
    3.7.1 原核表达载体的构建  33-34
    3.7.2 类PR10融合蛋白的表达和纯化  34-35
    3.7.3 类PR10蛋白RNase活性的检测  35-36
  3.8 PR1O-like-GFP融合蛋白的亚细胞定位  36-38
    3.8.1 PR10-like-PZP-GFP载体的构建  36
    3.8.2 瞬时表达PR10-like-GFP融合蛋白  36-37
    3.8.3 稳定表达PR10-like-GFP融合蛋白  37-38
  3.9 转类PR10基因植物的抗病性分析  38-42
    3.9.1 转基因载体PR-10-like-pzp的构建  38
    3.9.2 农杆菌介导的类PR10基因转化烟草  38-39
    3.9.3 类PR10转基因烟草中抗病抗病相关标记基因的表达  39-40
    3.9.4 类PR10转基因烟草侵染实验  40-42
四讨论  42-44
结论  44-45
参考文献  45-51
致谢  51

棉花抗黄萎病相关基因类Pr10的分离及功能分析

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