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nsdA同源性的研究及新型高产育种体系在棒状链霉菌中的应用

作　者: 余贞
导　师: 陶美凤
学　校: 华中农业大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 负调控基因nsdA neo报告基因盒棒状链霉菌克拉维酸 claR
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本论文的研究包括两部分内容，分别阐述如下：(1)负调节基因nsdA在链霉菌中的同源性研究nsdA是本实验室首次在天蓝色链霉菌中发现的一个全局性负调控基因。本研究的目的是研究nsdA在链霉菌中的序列保守性，探索该基因用于抗生素基因工程育种的潜力。根据已全基因组测序的天蓝色链霉菌和阿维链霉菌中的nsdA序列设计PCR引物，扩增吸水链霉菌5008、白色链霉菌JA3453、金色链霉菌211、变铅青链霉菌ZX64、链霉菌FR-008 DX600、吸水链霉菌10-22、庆丰链霉菌A553、小单孢菌40027等8个菌株的nsdA基因，并分别纯化后测序。除40027之外，其它7个菌株的nsdA同源基因序列均已得到，并递交GenBank数据库。将序列进行比较后，发现该基因在链霉菌中具有很高的相似性，表明nsdA基因在链霉菌中序列高度保守。(2)新型抗生素高产育种体系在提高克拉维酸产量上的应用报告基因辅助的微生物高产育种体系是本实验室建立的一种新型抗生素高产育种体系。该体系在阿维链霉菌中进行试验，表明它在提高阿维菌素产量上是可行的。本研究尝试将该育种体系运用到选育棒状链霉菌上，来提高CA的产量。首先将neo报告基因盒分别标记到CA合成基因簇的结构基因ORF7和ORF11，以及调节基因claR上，得到基因标记的载体pHL557、pHL558和pHL559。将这些质粒载体通过接合转移导入到棒状链霉菌NRRL3585中，得到在不同基因上标记的菌株YZ4、YZ5和YZ6。用NTG对标记菌株进行诱变后，筛选卡那霉素高抗性菌株，经HPLC分析，得到了4株诱变子的CA产量较出发菌株有明显提高。进一步分析发现，在结构基因上做标记的菌株，也就是分别在结构基因ORF7和ORF11下游耦连neo基因得到的菌株YZ4、YZ5，经第一轮诱变后，都筛选到了产量较诱变前有显著提高的诱变子，证明报告基因辅助的微生物高产育种这一体系在CA高产菌株的选育上具备可行性。而在调节基因claR上做标记的菌株经诱变后，还未筛选到诱变子产量较诱变前有明显提高的菌株，因此，该育种体系在选用调节基因作为待标记基因的可行性还有待进一步的实验证明。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略语  9-11
1 文献综述  11-25
  1.1 链霉菌简介  11-13
    1.1.1 链霉菌复杂的形态分化过程  11
    1.1.2 链霉菌的基因组特征  11-12
    1.1.3 链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌(S.coelicolor)A3(2)  12-13
    1.1.4 链霉菌是重要的工业微生物之一  13
  1.2 抗生素合成的调控及nsdA基因简介  13-14
  1.3 克拉维酸研究进展  14-21
    1.3.1 克拉维酸产生菌简介  14-15
    1.3.2 棒状链霉菌NRRL3585分子生物学研究概况  15-16
    1.3.3 克拉维酸及其作用机理简介  16-17
    1.3.4 克拉维酸生物合成途径及相关基因  17-20
    1.3.5 提高克拉维酸产量的可能途径  20-21
  1.4 利用λ-Red重组构建链霉菌基因置换载体  21-22
  1.5 微生物菌种选育  22-23
    1.5.1 常规的微生物菌种选育  22-23
    1.5.2 报告基因辅助的微生物高产育种体系  23
  1.6 本研究的工作基础、目的和意义  23-25
2 材料与方法  25-40
  2.1 材料  25-32
    2.1.1 菌株  25-26
    2.1.2 质粒  26-28
    2.1.3 引物  28-29
    2.1.4 培养基和生化试剂  29-32
    2.1.5 抗生素的使用侬度  32
  2.2 实验方法  32-40
    2.2.1 链霉菌培养及菌种保藏  32
    2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取  32-33
    2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测  33
    2.2.4 链霉菌总DNA的提取  33-34
    2.2.5 质粒从大肠杆菌向链霉菌的两亲本接合转移  34
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)及转化  34-35
    2.2.7 DNA片段凝胶回收  35
    2.2.8 AT克隆  35-36
    2.2.9 IPTG诱导的大肠杆菌中重组基因的表达  36
    2.2.10 PCR  36-37
    2.2.11 PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化  37-38
    2.2.12 NTG诱变链霉菌孢子  38-39
    2.2.13 克拉维酸的HPLC测定  39-40
3 结果与分析  40-73
  3.1 PCR扩增多种链霉菌中的nsdA基因及其序列比较  40-46
    3.1.1 PCR扩增多种链霉菌中nsdA同源基因序列  40-43
    3.1.2 多种链霉菌中nsdA基因的同源性比较  43-46
  3.2 构建在克拉维酸合成基因簇的结构基因ORF7上标记的菌株  46-56
    3.2.1 CA合成基因簇上ORF7基因及其侧翼片断的克隆  47-50
    3.2.2 标记ORF7的基因置换载体的构建  50-54
    3.2.3 通过基因置换构建ORF7标记的菌株  54-56
      3.2.3.1 基因中断和基因置换的基本原理  54-55
      3.2.3.2 双交换菌株的筛选  55-56
      3.2.3.3 ORF7标记菌株的PCR验证  56
  3.3 构建在CA合成基因簇的结构基因ORF11上标记的菌株  56-62
    3.3.1 CA合成基因簇上ORF11基因及其侧翼片断的克隆  57-59
      3.3.1.1 PCR扩增ORF11基因及其侧翼片断  57-58
      3.3.1.2 PCR产物的AT克隆  58
      3.3.1.3 克隆ORF11的左右臂到载体pHJL401上  58-59
    3.3.2 标记ORF11的基因置换载体的构建  59-61
    3.3.3 通过基因置换构建ORF11标记的菌株  61-62
      3.3.3.1 双交换菌株的筛选  61
      3.3.3.2 ORF11标记菌株的PCR验证  61-62
  3.4 构建在调节基因claR上做标记的菌株  62-65
    3.4.1 标记claR的基因置换载体的构建  62-64
    3.4.2 通过基因置换构建claR标记的菌株  64-65
  3.5 克拉维酸高产菌株的选育  65-69
    3.5.1 标记菌株CA产量的检测  65
    3.5.2 标记菌株对卡那霉素抗性的检测  65-66
    3.5.3 筛选卡那霉素高抗性菌株  66
    3.5.4 HPLC检测诱变菌株的CA产量  66-69
  3.6 改变培养条件来提高CA产量的初步尝试  69-73
4 总结与讨论  73-76
  4.1 总结  73-74
  4.2 讨论  74-75
  4.3 展望  75-76
参考文献  76-86
致谢  86

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