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高毒力大丽轮枝菌特异分泌蛋白基因VdSSP1的克隆和功能初步分析

作　者: 柳少燕
导　师: 戴小枫
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 大丽轮枝菌特异分泌蛋白基因敲除功能互补致病力
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大丽轮枝菌是引起棉花、茄子、黄瓜等多种农作物在内的200多种植物产生黄萎病的土传性病原真菌，引起的维管束病害给农作物尤其是棉花的生产造成了巨大的破坏。大丽轮枝菌在与寄主协同进化、异核融合和外界环境的影响下，呈现出极强的变异性，导致致病力发生变异而产生新的致病类型，致病机理极为复杂。一般认为，分泌到胞外的蛋白是引起黄萎病的主要因素，其作为一种毒力因子参与了大丽轮枝菌的致病机理，因此分泌型毒力因子已经成为当前黄萎病致病机制研究的热点。前期研究，课题组分别对高/低毒力大丽轮枝菌VDG1/VDG2进行了全基因组测序，通过比较基因组学确定了一个高毒力菌株特有的基因组片段SCF73，该片段全长27.1Kb，编码5个基因（VDG1₀1014-VDG1₀1018），该片段缺失后对棉花的致病力显著下降，表明SCF73与大丽轮枝菌的致病力显著相关。在此基础上，本论文首先对SCF73编码的5个基因进行了生物信息学分析，结果表明VDG1₀1014编码氧化还原酶，VDG1₀1016类似糖基水解酶家族18，VDG1₀1018编码甘露糖苷酶，VDG1₀1015、VDG1₀1017编码预测蛋白。同时结合SignalP3.0、TMHMM2.0、Wolfpsort、Phobius和Y-Loc预测分析发现，VDG1₀1016属于高毒力菌株VDG1特有的潜在分泌蛋白，推测其可能是SCF73上重要的分泌型毒力因子，命名为VdSSP1（Verticillium dahliaespecific secreted protein1）。采用cDNA末端快速克隆的方法克隆了VdSSP1，VdSSP1的cDNA全长1708bp，5’UTR为85bp，3’UTR为102bp，1521bp的开放阅读框编码506个氨基酸，通过基因组检测发现VdSSP1含有2个内含子，长度分别为110bp和116bp，对编码蛋白的预测分析表明VdSSP1属于典型的分泌蛋白。基因表达检测发现，VdSSP1在正常条件（蔗糖为唯一碳源）下不表达，但受植物细胞壁组分（淀粉为唯一碳源3d、果胶为唯一碳源5d）诱导表达，而且VdSSP1在大丽轮枝菌侵染棉花胚轴组织5d后被诱导表达，表明VdSSP1可能与植物细胞壁组分的降解利用及病原菌的侵染过程密切相关。应用酵母信号肽跟踪系统对VdSSP1的分泌特性进行检测，发现VdSSP1信号肽可以介导毕赤酵母的蔗糖酶（invertase）分泌到胞外，在以蔗糖为碳源的CMD-W培养基和棉籽糖（raffinose）为碳源的YPRAA培养基上正常生长，可以将2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）还原为红色的1,3,5-三苯甲臜，表明VdSSP1在大丽轮枝菌中具有分泌到胞外的特性，属于分泌蛋白。构建了VdSSP1同源双交换定点敲除载体pGKO2::VdSSP1，通过农杆菌介导法导入VDG1菌株中，经过抗性筛选、单孢分离和分子鉴定，获得了VdSSP1缺失突变株ΔVdSSP1。致病力检测发现，突变株对棉花的致病力相对于野生型显著下降，病情指数由49.16±0.68下降为35.92±0.81；同时，突变株在果胶和淀粉为唯一碳源的培养基上生长受限，生长直径分别仅为野生型的28.39%和57.67%。随后构建了具有遗传霉素抗性的功能互补载体pCg-Gen::VdSSP1，通过农杆菌介导法导入ΔVdSSP1并获得了缺失突变株的功能互补转化子。致病力鉴定表明，类似野生型菌株（病情指数为49.17±0.68），功能互补转化子的致病力较突变株显著提高，病情指数为44.91±0.74；而且功能互补转化子在果胶和淀粉培养基上的生长表型获得部分恢复。进一步研究发现，在缺失VdSSP1的低毒力大丽轮枝菌VDG2中过表达该基因，转化子的致病力显著提高，病情指数由21.36±1.01上升到36.23±3.84。结果表明，VdSSP1与大丽轮枝菌的致病力和植物细胞壁组分的降解利用密切相关。综上，VdSSP1是一个高毒力大丽轮枝菌VDG1相对于低毒力大丽轮枝菌VDG2特有的基因，编码蛋白具有分泌特性，与大丽轮枝菌的致病力密切相关，参与了植物细胞壁组分果胶和淀粉的降解作用，是大丽轮枝菌侵染寄主（棉花）的一个分泌型毒力因子。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章绪论  13-19
  1.1 黄萎病及其危害  13
  1.2 黄萎病菌侵染过程与致病机制  13-14
  1.3 大丽轮枝菌致病机理研究  14-18
    1.3.1 大丽轮枝菌致病相关基因  14-15
    1.3.2 分泌蛋白与黄萎病致病机理  15-17
    1.3.3 碳水化合物酶类与黄萎病致病机理  17-18
  1.4 本研究的目的和意义  18-19
第二章高毒力大丽轮枝菌 VDG1 特异基因组区段 SCF73 的鉴定与分析  19-27
  2.1 实验材料  19
  2.2 实验方法  19-21
    2.2.1 特异基因组区段 SCF73 的分析  19
    2.2.2 大丽轮枝菌的培养  19
    2.2.3 大丽轮枝菌基因组提取  19-20
    2.2.4 特异基因组区段 SCF73 的 PCR 验证  20-21
    2.2.5 特异基因组区段 SCF73 上编码基因分析  21
    2.2.6 特异基因组区段 SCF73 上编码基因的功能注释  21
    2.2.7 特异基因组区段 SCF73 上基因编码蛋白的分泌特性预测  21
  2.3 实验结果  21-26
    2.3.1 高毒力菌株 VDG1 特异基因组区段 SCF73 的筛选与 PCR 验证  21-22
    2.3.2 特异基因组区段 SCF73 上编码基因分析  22-24
    2.3.3 特异基因组区段 SCF73 上编码基因功能注释  24
    2.3.4 特异基因组区段 SCF73 上特异基因编码蛋白的分泌特性预测  24-26
  2.4 讨论  26-27
第三章大丽轮枝菌 VDG1 特异分泌蛋白基因 VdSSP1 的克隆与表达分析  27-42
  3.1 实验材料  27
    3.1.1 菌株与棉花材料  27
    3.1.2 实验试剂与仪器  27
  3.2 实验方法  27-37
    3.2.1 大丽轮枝菌培养与诱导  27-28
    3.2.2 大丽轮枝菌侵染寄主棉花  28
    3.2.3 大丽轮枝菌 DNA 提取  28
    3.2.4 RNA 提取  28-29
    3.2.5 cDNA 合成与表达检测  29-31
    3.2.6 cDNA 末端快速克隆  31-34
    3.2.7 PCR 产物回收、克隆、转化、筛选和测序  34-35
    3.2.8 VdSSP1 全长基因扩增  35-36
    3.2.9 VdSSP1 基因生物信息学分析  36-37
  3.3 实验结果  37-40
    3.3.1 VdSSP1 表达分析  37-38
    3.3.2 VdSSP1 基因克隆  38-39
    3.3.3 VdSSP1 基因基本特性分析  39-40
  3.4 讨论  40-42
第四章大丽轮枝菌 VdSSP1 基因功能初步研究  42-73
  4.1 实验材料  42-44
    4.1.1 质粒和菌株  42
    4.1.2 抗生素及使用浓度  42-43
    4.1.3 培养基及培养条件  43-44
  4.2 实验方法  44-60
    4.2.1 VdSSP1 信号肽重组载体的构建  44-45
    4.2.2 重组载体的酵母转化  45-46
    4.2.3 信号肽活性测定  46-47
    4.2.4 基因敲除载体的构建  47-50
    4.2.5 重组质粒导入农杆菌  50-51
    4.2.6 农杆菌介导的大丽轮枝菌遗传转化  51
    4.2.7 大丽轮枝菌遗传转化子单孢纯化与分子鉴定  51-53
    4.2.8 功能互补载体构建  53-58
    4.2.9 大丽轮枝菌功能互补转化子筛选与鉴定  58
    4.2.10 生长表型鉴定  58-59
    4.2.11 致病力测定  59-60
  4.3 实验结果  60-70
    4.3.1 VdSSP1 信号肽活性测定  60-61
    4.3.2 基因敲除质粒的构建  61-62
    4.3.3 基因敲除转化子的筛选鉴定  62-64
    4.3.4 功能互补载体的构建  64-67
    4.3.5 功能互补转化子的筛选鉴定  67
    4.3.6 突变株与互补转化子生长表型鉴定  67-69
    4.3.7 突变株致病力测定  69-70
  4.4 讨论  70-73
第五章全文结论  73-74
参考文献  74-82
附录Ⅰ  82-84
附录Ⅱ  84-85
致谢  85-86
作者简历  86

高毒力大丽轮枝菌特异分泌蛋白基因VdSSP1的克隆和功能初步分析

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