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小鼠Klhdc10基因的表达与胚胎发育关系的研究

作　者: 孔凡涛
导　师: 吴琼
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Klhdc10 胚胎发育原位杂交定量RT-PCR
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

小鼠Klhdc10基因是Kelch基序重复超家族成员之一。目前,研究发现该家族的很多基因参与多种生理过程并且在发育过程中对组织形态发生起重要作用。然而,尚未见关于Klhdc10的研究报道。为了探究Klhdc10在小鼠胚胎发育中的时空表达模式,本文通过半定量RT-PCR、原位杂交和实时荧光定量RT-PCR等技术,对Klhdc10基因在发育期的表达模式进行分析,以期为今后功能的研究奠定基础。生物信息学分析显示,小鼠Klhdc10与人源KLHDC10氨基酸序列的同源性达96.61%,并且都含有2个高度保守的Kelch基序。半定量RT-PCR结果显示,在胚胎发育的9.5-18.5天(E9.5-E18.5)的小鼠全胚胎中,均能检测到Klhdc10基因mRNA的表达,在E11.5天表达量最高。原位杂交结果显示,在E9.5天,Klhdc10基因表达信号主要集中在颅面部,特别是在端脑和视泡部位信号最强。在E10.5天和E11.5天,表达信号主要集中在端脑、间脑、中脑和菱脑。在E12.5和E15.5天小鼠的脑、舌及背部肌肉中均检测到较强的Klhdc10 mRNA信号,并且在E15.5天小鼠的肝和肾中也有较强表达。实时定量RT-PCR结果显示,Klhdc10的mRNA在E12.5、E15.5和E18.5天小鼠脑中有较高的表达趋势,而在心和肺中表达量相对较低;在E12.5、E15.5天的舌和肾及E18.5天的肝中也有较高的表达。进一步检测其在脑发育过程中的表达,结果显示Klhdc10在E12.5、E15.5和出生后第0天(P0)天小鼠脑的新脑皮、小脑和海马等部位广泛表达,然而在P7天主要在小脑有较强的表达。在脑中,Klhdc10的mRNA表达水平随着胚胎的发育逐渐升高,在E15.5天出现峰值,随后表达量虽有下降的趋势,但一直到出生仍维持相对较高的水平。在胎盘发育过程中,Klhdc10表达信号在E10.5和E12.5天主要集中在迷路层,而在E15.5、E16.5和E18.5天主要位于成胶质细胞层。Klhdc10的mRNA在E11.5-E15.5天胎盘中保持较低的表达水平,在E16.5天表达量出现最大值,随后表达量有下降的趋势但仍然保持相对较高的表达水平。以上研究结果显示Klhdc10在小鼠胚内和胚外胎组织中普遍表达并呈现动态的表达模式,暗示其可能参与胚内及胚外组织的发生过程,并且在小鼠的胚胎发育过程中可能起重要的作用。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第1章绪论  8-15
  1.1 课题背景及研究的目的和意义  8
  1.2 国内外研究现状及相关知识概述  8-14
    1.2.1 Kelch基序研究现状  8-9
    1.2.2 Kelch基序重复超家族成员研究现状  9-11
    1.2.3 小鼠重要组织器官的发生与发育  11-13
    1.2.4 胎盘的形成与发育  13-14
  1.3 研究内容  14-15
第2章材料和方法  15-26
  2.1 实验材料与试剂  15-18
    2.1.1 实验动物及菌种  15
    2.1.2 实验试剂  15-16
    2.1.3 实验仪器  16-17
    2.1.4 分析软件及生物学网站  17-18
  2.2 实验方法  18-25
    2.2.1 实验胚胎制备  18
    2.2.2 半定量及定量RT-PCR  18-20
    2.2.3 RNA探针的制备  20-22
    2.2.4 原位杂交  22-25
  2.3 本章小结  25-26
第3章实验结果  26-42
  3.1 Klhdc10 基因的生物信息学分析  26-28
    3.1.1 Klhdc10 的基因结构及保守性分析  26-27
    3.1.2 Klhdc10 蛋白的疏水性及二级结构预测  27-28
  3.2 Klhdc10 基因RNA探针的合成  28-30
    3.2.1 目的片段的RT-PCR扩增  28-29
    3.2.2 蓝白斑筛选及菌落PCR  29-30
    3.2.3 RNA探针合成  30
  3.3 Klhdc10 在小鼠胚胎中的表达分析  30-38
    3.3.1 RT-PCR分析Klhdc10 在全胚胎中的表达  30-31
    3.3.2 原位杂交分析Klhdc10 在胚胎发育期的表达  31-35
    3.3.3 Klhdc10 在胚胎不同组织间表达的定量分析  35-36
    3.3.4 Klhdc10 在脑不同发育期表达的定量分析  36
    3.3.5 原位杂交分析Klhdc10 在脑发育期的表达  36-38
  3.4 Klhdc10 在胎盘中的表达分析  38-40
    3.4.1 原位杂交分析Klhdc10 在胎盘中的表达  38-40
    3.4.2 Klhdc10 在胎盘中表达的定量分析  40
  3.5 Klhdc10 在不同小鼠品系的SNP检索  40
  3.6 本章小结  40-42
第4章讨论  42-47
  4.1 Klhdc10 与小鼠胚胎器官发育的关系  42-44
  4.2 Klhdc10 与胎盘的发育的关系  44-45
  4.3 Klhdc10 生物信息学分析及SNP检索  45-47
结论  47
展望  47-48
参考文献  48-54
附录1 质粒测序结果  54-55
附录2 寻找SNP测序结果  55-58
攻读学位期间发表的学术论文  58-60
致谢  60

小鼠Klhdc10基因的表达与胚胎发育关系的研究

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