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规模化秸秆沼气反应器中微生物群落结构分析

作　者: 崔文文
导　师: 张克强
学　校: 中国农业科学院
专　业: 环境工程
关键词: 秸秆沼气发酵微生物群落 T-RFLP 克隆文库
分类号: X712
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

中国是世界上秸秆资源最丰富的国家之一。利用农作物秸秆进行厌氧发酵产沼气，是一条清洁高效的秸秆能源化利用途径，但在秸秆沼气发酵过程中存在着产气不稳定等问题。因此，明确沼气发酵中的微生物群落，可为摸清以农作物秸秆为原料的厌氧沼气发酵规律，优化厌氧发酵工艺，保证厌氧反应器稳定运行及提高沼气产气率提供理论依据。本文采用现代分子生物学分析方法，通过基于PCR的T-RFLP和克隆文库构建相结合的研究方法，对秸秆沼气工程中细菌、甲烷古菌与厌氧纤维素降解菌的群落结构进行分析，结果表明：(1)供试秸秆沼气发酵体系中细菌种类十分丰富，主要属于七大类群，分别为Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Tenericutes（无壁菌门）、Actinobacteria（放线菌）和Synergistetes。其中以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主，三者分别占库容40.48%、30.1%与21.45%。其中的的优势细菌共有5种，经与Genebank中数据比较，分别类似于Thermopolyspora flexuosa、Clostridium jejuense、Solirubrobactersoli、Pseudomonas pseudoalcaligenes和Clostridium innocuum；(2)供试秸秆沼气发酵体系中古菌主要属于Euryarchaeota（广古菌门），包括七个属，分别为Methanobacterium（甲烷杆菌属）、Methanosphaerula（甲烷微菌属）、Methanocorpusculum（甲烷粒菌属）、Methanosarcina（甲烷八叠球菌属）、Methanosaeta（甲烷鬃毛菌属）、Methanolinea（甲烷绳菌属）、Methanospirillum（甲烷螺菌）。以秸秆为主要原料的厌氧发酵过程中，甲烷鬃菌属为优势微生物，相对丰度为69.2%-71.9%，而在秸秆与畜禽粪便混合发酵过程中，甲烷八叠球菌为优势微生物，相对丰度为73.1%。(3)供试秸秆沼气发酵体系中厌氧纤维素降解菌主要属于Firmicutes（厚壁菌门），包括Clostridium（梭菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Ruminococcus（瘤胃球菌属）、Paenibacillus（类芽孢杆菌属）四个属。其中主要的优势种群为Clostridium cellulovorans、Bacillus licheniformis和Clostridium stercorarium，体系中三者的相对丰度分别为14.41%-70.06%、10.88%-14.23%和10.11%-19.87%。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章引言  12-20
  1.1 中国规模化秸秆沼气工程现状  12-15
    1.1.1 秸秆的分布特征及特性  12
    1.1.2 秸秆原料预处理方法  12-13
    1.1.3 秸秆沼气发酵工艺类型  13-15
    1.1.4 沼气利用方式  15
  1.2 沼气发酵厌氧生物降解过程  15-17
    1.2.1 厌氧消化过程  15-16
    1.2.2 不产甲烷菌和产甲烷菌的关系  16
    1.2.3 厌氧纤维素降解菌在秸秆沼气工程中的作用  16-17
  1.3 秸秆沼气工程中微生物群落研究方法  17-19
    1.3.1 分子生物学研究微生物的方法  17-18
    1.3.2 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术  18-19
  1.4 研究目的和意义  19-20
第二章我国规模化秸秆沼气工程调研与样品采集  20-22
  2.1 秸秆沼气工程调研方法与内容  20
    2.1.1 调研范围  20
    2.1.2 调研内容  20
    2.1.3 我国规模化秸秆沼气工程的总体状况  20
  2.2 样品采集  20-22
第三章秸秆沼气工程中细菌群落结构分析  22-44
  3.1 实验材料  22-23
    3.1.1 厌氧污泥样品来源  22
    3.1.2 分子生物学试剂及培养基  22
    3.1.3 主要实验仪器及实验耗材  22-23
  3.2 实验方法  23-30
    3.2.1 基因组 DNA 提取  23-24
    3.2.2 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析  24-26
    3.2.3 克隆文库构建  26-30
  3.3 试验结果与分析  30-43
    3.3.1 基因组 DNA 提取结果  30
    3.3.2 细菌 T-RFLP 结果分析  30-33
    3.3.3 克隆文库  33-42
    3.3.4 T-RFLP 与克隆文库结果结合分析  42-43
  3.4 小结  43-44
第四章秸秆沼气工程中古菌群落结构分析  44-57
  4.1 实验材料  44
  4.2 实验方法  44-47
    4.2.1 基因组 DNA 提取  44
    4.2.2 T-RFLP 方法  44-45
    4.2.3 克隆文库方法  45-47
  4.3 实验结果与分析  47-56
    4.3.1 细菌 T-RFLP 结果分析  47-50
    4.3.2 克隆文库  50-55
    4.3.3 T-RFLP 与克隆文库结果结合分析  55-56
  4.4 小结  56-57
第五章秸秆沼气工程中纤维素降解菌的多样性分析及菌株初步分离  57-70
  5.1 实验材料  57
    5.1.1 厌氧污泥样品来源  57
    5.1.2 分子生物学试剂及培养基  57
    5.1.3 主要实验仪器及实验耗材  57
  5.2 实验方法  57-60
    5.2.1 基因组 DNA 提取  57
    5.2.2 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析  57-59
    5.2.3 克隆文库构建  59-60
    5.2.4 厌氧纤维素菌初步分离  60
  5.3 实验结果与分析  60-69
    5.3.1 Cel48 基因 T-RFLP 结果分析  60-62
    5.3.2 克隆文库  62-67
    5.3.3 T-RFLP 与克隆文库结果结合分析  67-68
    5.3.4 厌氧纤维素菌初步分离  68-69
  5.4 小结  69-70
第六章结论及工作展望  70-72
  6.1 结论  70
  6.2 工作展望  70-72
参考文献  72-77
致谢  77-78
作者简介  78

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