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异常毕赤酵母（Pichia anomala）HN1-2菌株产单细胞蛋白和嗜杀因子的研究

作　者: 孙怀永
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 红树林 单细胞蛋白 嗜杀因子 固体发酵 异常毕赤酵母
分类号: TQ920.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


红树林生态系统分布在全球112个国家，总面积达到181000Km~2，覆盖了世界热带和亚热带60%～75%的海岸线。中国现存的红树林约占世界红树林面积的0.1%。红树林中含有丰富的微生物资源，其中已分离鉴定出的真菌超过100种，成为海洋真菌的第二大类群。本论文从红树林生态系统中分离得到一株同时产单细胞蛋白和嗜杀因子的酵母菌株HN1-2，通过传统方法和分子生物学方法的鉴定，该菌株属于异常毕赤酵母，这是该现象的首次报道。本论文以廉价的豆饼粉水解液为基础，通过单因子优化的方法，对异常毕赤酵母HN1-2菌株液体发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子的条件进行了优化。最终确定最佳培养基组成（w/v）为：4.0%豆饼粉水解液，3.0%葡萄糖。最佳起始pH4.0，最佳接种量（v/v）为8.0%（OD600nm=8.3），最佳培养温度28℃。在5-L发酵罐中发酵时，该嗜杀菌株在12h内即可产生大量的单细胞蛋白和嗜杀因子。此时，菌体细胞的蛋白含量、生物量、还原糖含量以及透明圈直径分别达到56.0%（w/w），7.3g/L，9.5g/L和19.0mm。对发酵后菌体细胞的氨基酸组成进行分析的结果显示，菌体细胞中含有大量的必需氨基酸，如赖氨酸（含量占总蛋白的7.8%）、甲硫氨酸（含量占总蛋白的1.8%）和亮氨酸（含量占总蛋白的9.0%）。以对虾肌肉蛋白为参考蛋白时，必需氨基酸指数（EAAI）为1.04，属于优质蛋白源。异常毕赤酵母HN1-2菌株分泌的嗜杀因子可以杀死长孢路德酵母、白色假丝酵母、二尖梅奇酵母、季也蒙毕赤酵母、酒精酵母、解脂耶罗威亚酵母以及海尼克鲁维酵母等自然界中广泛存在的多种酵母，但对丝状真菌和细菌没有嗜杀活性。通过与敏感野生菌株共培养的研究，发现异常毕赤酵母HN1-2菌株在生长过程中可以防止野生菌株的污染，这在发酵工业中意义重大。生产单细胞蛋白的一种重要方法是固体发酵（SSF）。通过单因子优化的方法，对以麦麸-稻壳混合物为基质的固体发酵条件进行优化。最终确定最佳条件为：基质含水量45%（w/w），葡萄糖浓度1.5%（w/w），硫酸铵浓度为0.3%（w/w），pH4.5，发酵温度28℃。发酵24h后，固体混合物的平均蛋白含量由发酵前的14.23%（w/w）提高到29.78%（w/w），透明圈直径达到10.1mm。通过固体发酵的方式提高混合物的蛋白含量，增加其饲用价值，这在畜牧业中具有重要意义。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 绪论  11-31
  1. 红树林生态系统  11-14
    1.1 红树林生态系统简介  11
    1.2 红树林生态系统在中国的分布  11-12
    1.3 红树林生态系统中的微生物资源  12-14
      1.3.1 红树林生态系统中的细菌  12-13
      1.3.2 红树林生态系统中的放线菌  13
      1.3.3 红树林生态系统中的真菌  13-14
  2. 嗜杀因子  14-21
    2.1 嗜杀因子和嗜杀酵母简介  14
    2.2 产嗜杀因子的真菌及其应用前景  14-17
      2.2.1 产嗜杀因子的真菌  14-16
      2.2.2 嗜杀因子和嗜杀酵母的应用前景  16-17
    2.3 嗜杀因子的性质  17-19
      2.3.1 分子量  17
      2.3.2 影响嗜杀因子作用的因素  17-19
    2.4 嗜杀作用机理及检测方法  19-21
      2.4.1 嗜杀因子受体  19-20
      2.4.2 嗜杀因子对敏感细胞的作用  20-21
      2.4.3 嗜杀因子检测方法  21
  3. 单细胞蛋白  21-29
    3.1 单细胞蛋白简介  21-22
    3.2 单细胞蛋白的来源及生产单细胞蛋白的底物  22-25
    3.3 单细胞蛋白的营养价值及其来源的限制因素  25-28
      3.3.1 藻类的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制  25-26
      3.3.2 真菌的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制  26-27
      3.3.4 细菌的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制  27-28
    3.4 单细胞蛋白生产的优化  28-29
  4. 本论文的研究内容和意义  29-31
第二章 高蛋白含量同时产嗜杀因子的菌株的筛选及鉴定  31-43
  0. 前言  31
  1.材料与方法  31-37
    1.1 菌种  31
    1.2 培养基与试剂  31-33
      1.2.1 培养基  31-32
      1.2.2 试剂  32-33
    1.3 试验方法  33-37
      1.3.1 高蛋白含量菌株的筛选  33-34
      1.3.2 嗜杀活性的检测  34
      1.3.3 酵母菌种鉴定  34-37
  2. 结果与讨论  37-42
    2.1 高蛋白含量菌株的筛选结果  37
    2.2 高蛋白含量菌株嗜杀活性的检测  37-38
    2.3 菌种鉴定结果  38-42
      2.3.1 常规方法鉴定结果  38-40
      2.3.2 分子生物学方法鉴定结果  40-42
  3. 本章小结  42-43
第三章 异常毕赤酵母HN1-2菌株液体发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子的研究  43-60
  0. 前言  43-44
  1. 材料与方法  44-48
    1.1 菌种  44
    1.2 培养基与试剂  44-45
      1.2.1 培养基  44
      1.2.2 试剂  44-45
    1.3 试验方法  45-48
      1.3.1 粗蛋白含量的测定  45
      1.3.2 生物量的测定  45
      1.3.3 嗜杀因子产量的检测  45
      1.3.4 摇瓶发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子最佳条件的确定  45-47
      1.3.5 摇瓶发酵中菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径随时间的变化  47
      1.3.6 在 5-L 发酵罐中发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子  47
      1.3.7 还原糖含量的测定  47
      1.3.8 总糖含量的测定  47
      1.3.9 氨基酸组成的分析  47-48
      1.3.10 必需氨基酸指数（EAAI）的计算  48
  2. 结果与讨论  48-59
    2.1 摇瓶发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子条件的优化  48-55
      2.1.1 豆饼粉水解液浓度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响  49
      2.1.2 NaCl 浓度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响  49-50
      2.1.3 不同碳源及其浓度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响  50-52
      2.1.4 不同起始 pH 对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响  52-53
      2.1.5 培养温度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响  53-54
      2.1.6 接种量对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响  54-55
    2.2 摇瓶发酵中菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径随时间的变化  55-56
    2.3 在 5-L 发酵罐中发酵产单细胞蛋白和嗜杀因子  56-57
    2.4 异常毕赤酵母 HN1-2 菌株细胞氨基酸组成的分析  57-59
  3. 本章小结  59-60
第四章 异常毕赤酵母HN1-2菌株培养过程中防污染的研究及固体发酵的初步研究  60-78
  0. 前言  60-61
  1. 材料与方法  61-65
    1.1 菌种  61
    1.2 培养基与试剂  61-62
      1.2.1 培养基  61-62
      1.2.2 试剂  62
    1.3 试验方法  62-65
      1.3.1 异常毕赤酵母 HN1-2 菌株杀菌谱的测定  62
      1.3.2 异常毕赤酵母 HN1-2 菌株培养过程中防止野生菌株污染的研究  62-63
      1.3.3 发酵体系平均蛋白含量的测定  63
      1.3.4 嗜杀因子产量的检测  63
      1.3.5 异常毕赤酵母 HN1-2 菌株固体发酵产单细胞蛋白和嗜杀因子条件的优化  63-65
      1.3.6 固体发酵时平均蛋白含量和透明圈直径随时间的变化  65
  2. 结果与讨论  65-77
    2.1 异常毕赤酵母 HN1-2 菌株的杀菌谱  65-66
    2.2 异常毕赤酵母 HN1-2 菌株培养过程中防止野生菌株污染的研究  66-68
    2.3 异常毕赤酵母 HN1-2 菌株固体发酵产单细胞蛋白和嗜杀因子条件的优化  68-76
      2.3.1 固体基质含水量对平均蛋白含量和透明圈直径的影响  68-69
      2.3.2 不同碳源及其浓度对平均蛋白含量和透明圈直径的影响  69-71
      2.3.3 接种量对平均蛋白含量和透明圈直径的影响  71-72
      2.3.4 不同 pH 对平均蛋白含量和透明圈直径的影响  72-73
      2.3.5 不同发酵温度对平均蛋白含量和透明圈直径的影响  73-74
      2.3.6 不同氮源及其浓度对平均蛋白含量和透明圈直径的影响  74-76
    2.4 固体发酵时平均蛋白含量和透明圈直径随时间的变化  76-77
  3. 本章小结  77-78
论文总结与创新点  78-80
参考文献  80-95
附录：英文缩写符号及其中英文名称  95-96
致谢  96-97
个人简历及发表的学术论文  97

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 发酵工艺
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