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利用水稻原生质体瞬时表达体系研究OsHK3在ABA诱导的抗氧化防护过程中的功能

作　者: 秦婷婷
导　师: 蒋明义
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻 ABA 抗氧化防护 OsHK3
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)作为重要的信号分子可以参与调节植物抵抗逆境(低温胁迫、干旱、盐胁迫等)的多种生理反应。已有研究表明ABA能够通过诱导活性氧(reactive oxides, ROS)的产生以及抗氧化基因的表达等途径,提高植物抗氧化防护能力。双组分系统(two-component system, TCS)是通过组氨酸激酶(histidinekinase,HK)磷酸化对多种生理过程进行感知和调节的一类信号传递系统,在低等生物和高等植物中都起到重要的作用。但是关于ABA诱导的抗氧化胁迫信号途径与水稻TCS系统的关系方面的研究并不多。本实验室前期从水稻OsHKs基因家族(OsHK1-6)中筛选出响应ABA信号的基因：OsHK3.研究发现ABA能诱导水稻OsHK3基因的表达。鉴于上述研究背景,为了进一步了解OsHK3的性质,我们以经ABA处理的粳稻(Oryza sativa L.)品种徐稻4号幼苗的RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增OsHK3完整的基因编码区。OsHK3基因开放阅读编码框(open reading frame,ORF)3072bp,编码1023个氨基酸,具有典型的HK保守结构域：CHASE域,传递域(transmitter domain),接受域(receive domain)。根据预测分析,OsHK3还有两个跨膜域(trans-membrane domain)。我们将OsHK3与拟南芥中的杂合型组氨酸激酶的氨基酸序列通过ClustalW2软件比对分析后发现,OsHK3具有关键的保守位点：HisKA区中的His残基和REC中的DDK序列,表明OsHK3可能具有完整的组氨酸激酶活性。为研究水稻OsHK3基因与ABA诱导的抗氧化防护体系的关系,我们建立了水稻幼苗原生质体瞬时过表达体系。利用基因重组技术,将OsHK3全长基因插入到原生质体瞬时表达载体pXZP008上,构成pXZ-OsHK3重组载体。将重组载体pXZ-OsHK3用PEG融合法转化水稻原生质体,28℃暗培养过夜。研究发现：8小时后,原生质体抗氧化防护系统中SODCc2、APXA、CATB基因表达与对照相比显著上调；16小时后,SOD、APX、CAT活性与对照相比显著增强。SOD、APX总活性提高了2-3倍,CAT总活性也有了明显的提高。根据上述实验结果,我们推测：OsHK3可能参与了ABA诱导的抗氧化防护反应。为进一步研究OsHK3基因与ABA诱导的抗氧化防护应答的关系,我们建立了双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)瞬时干扰体系。在体外转录合成以OsHK3编码区基因片段为模板的dsRNA,用合成的dsRNA转染水稻原生质体,再用ABA处理转染24小时后的原生质体。研究发现：ABA作用下,APXA、CATB、SODCc2基因表达显著增强。OsHK3沉默后,APXA、CATB、SODCc2表达显著降低,外源ABA处理OsHK3沉默后的原生质体后,APXA、CATB、SODCc2表达略有增强,但仍低于对照水平。外源ABA能显著提高SOD、APX、CAT活性。OsHK3被干扰后, SOD、APX总活性分别降低50%和40%,CAT总活性也明显降低。用ABA处理OsHK3沉默后的原生质体,SOD、APX、CAT的活性略有上调,但仍不能恢复到对照水平。上述实验结果从另一方面证明了OsHK3参与了ABA诱导的抗氧化防护应答。为研究OsHK3的亚细胞定位,我们利用基因重组技术,将OsHK3全长基因构建到原生质体瞬时表达载体pXZP008上,得到重组表达载体pXZ-OsHK3。我们一方面将重组载体pXZ-OsHK3用PEG融合法转化水稻原生质体,另一方面利用基因枪轰击法将pXZ-OsHK3导入洋葱表皮。以YFP为报告基因,通过激光共聚焦扫描显微镜观察蛋白在细胞中的定位。初步确定OsHK3定位于细胞膜和细胞质中。以上实验结果初步阐明了OsHK3基因在ABA诱导的抗氧化防护过程的作用,为ABA诱导植物细胞抗氧化防护系统的信号转导途径提供了新的证据。

利用水稻原生质体瞬时表达体系研究OsHK3在ABA诱导的抗氧化防护过程中的功能

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