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红花玉兰MAwuAG基因功能鉴定及其近缘种同源序列进化分析

作　者: 吴文韬
导　师: 陈发菊; 刘志雄
学　校: 三峡大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 红花玉兰花发育 MADS-box基因 AGAMOUS
分类号: S685.15
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

红花玉兰（Magnolia wufengensis）是木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Magnolia）近年发现的新种，其花被片9瓣到32瓣不等，花色浓淡不同，丰富的自然变异类型和在系统演化上所处的重要位置，使其成为研究花器官形态建成和发育演变的理想材料。AGAMOUS(AG)是拟南芥重要的C类MADS-box基因，在花发育过程中具有促进花分生组织形成，参与调控雌雄蕊发育，抑制A类基因活性等生理功能。大量研究表明，AGAMOUS同源基因在调控模式植物、主要农作物和重要经济花卉花发育过程中的功能相当保守性。本研究结合发育生物学和分子生物学等多学科手段，在弄清红花玉兰AGAMOUS同源基因在花发育过程中的表达模式和生理功能基础上，进一步对其近缘种同源序列进行系统发生分析和进化树重建，从分子水平探讨红花玉兰的演化地位及其近缘种的发育演化关系。主要结论如下：（1）红花玉兰AGAMOUS同源基因的克隆和表达分析同源克隆的方法结合RACE技术，从红花玉兰中分离出了参与花发育的C类MADS-box基因MAwuAG。蛋白序列比对及分子系统发生分析表明，MAwuAG为拟南芥的AG同源蛋白，其C末端的转录激活区含有两个保守的基元：AGⅠ和AGⅡ基元。半定量RT-PCR和Northern杂交分析表明，在花发育过程中，红花玉兰MAwuAG基因仅在雄蕊和雌蕊中表达，而在叶片和花被片未检测到转录信号，其表达组织特异性与拟南芥相同。（2）红花玉兰AGAMOUS同源基因的功能鉴定。构建由CaMV35S启动子控制的MAwuAG基因的正义表达载体，并通过农杆菌介导的方法导入拟南芥，筛选并鉴定阳性转化植株，并对拟南芥转基因植株进行表型分析。结果表明，与野生型拟南芥相比，35S::MAwuAG的拟南芥转基因植株明显早花；叶片内卷且表皮毛伸长；萼片和花瓣变小，花瓣基部同源异型转变成花丝状结构；雄蕊和心皮变大。另外，角果发育过程中，外三轮的花器官缩存，角果畸形且结实率低。（3）红花玉兰近缘种MAwuAG同源基因的进化分析选取木兰科4个属共39种植物，分别克隆其AGAMOUS同源基因，对这些序列进行系统发生和进化树重建。结果表明：鹅掌楸亚科和木兰亚科的分类地位在树上得到了很好的支持；进一步对木兰亚科38种植物的演化关系进行分析发现，木兰亚科中木莲属与深山含笑聚为一个进化分支，成为一个单系类群，并与凹叶厚朴亲缘关系较近；木兰属并不是一个单系类群，其中木兰亚属的常绿组聚为一个进化分支，玉兰亚属则与含笑属聚为一个进化分支，红花玉兰属玉兰亚属植物。以上几部分实验结果分析表明，MAwuAG是拟南芥的AGAMOUS同源基因，其仅在雄蕊和雌蕊中表达，功能十分保守；MAwuAG基因与其近缘种AGAMOUS同源序列的分子系统发生分析表明，红花玉兰属玉兰亚属植物。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
缩略词与专有名词明细  8-9
图表明细  9-10
目录  10-13
1 文献综述  13-22
  1.1 植物花发育的分子机制研究进展  13-18
    1.1.1 花形态建成的分子基础  13-16
    1.1.2 植物 AGAMOUS 同源基因研究进展  16-18
  1.2 木兰科植物花发育与系统演化研究现状  18-20
  1.3 本研究的目的、意义和技术路线  20-22
    1.3.1 本研究的目的意义  20-21
    1.3.2 本文的技术路线  21-22
2 红花玉兰 AGAMOUS 同源基因克隆、序列结构及表达分析  22-49
  2.1 试验材料  22-23
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 菌株和载体  22
    2.1.3 试剂与仪器  22
    2.1.4 引物合成与 DNA 测序  22-23
    2.1.5 培养基与抗生素  23
  2.2 方法  23-40
    2.2.1 CTAB 法提取红花玉兰花芽总 RNA  23-25
    2.2.2 第一链 cDNA 的合成  25-26
    2.2.3 红花玉兰 AGAMOUS 同源基因核心片断的克隆  26-28
    2.2.4 红花玉兰 AGAMOUS 同源基因 3′端序列的克隆  28-29
    2.2.5 红花玉兰 AGAMOUS 同源基因 5′端序列的克隆  29-33
    2.2.6 红花玉兰 AGAMOUS 基因 cDNA 全长序列的克隆  33
    2.2.7 蛋白质序列比对及系统发生分析  33-35
    2.2.8 半定量 RT-PCR 与组织表达特异性分析  35-36
    2.2.9 红花玉兰 AGAMOUS 表达的 Northern 分析  36-40
  2.3 结果与分析  40-47
    2.3.1 红花玉兰 AGAMOUS 基因 cDNA 全长序列的克隆  40-42
    2.3.2 红花玉兰中 AG 同源基因 MAwuAG 基因序列结构分析  42-44
    2.3.3 红花玉兰中 AG 同源基因分子系统发生分析  44-46
    2.3.4 MAwuAG 半定量分析  46
    2.3.5 MAwuAG 在红花玉兰中表达的 northern blot 分析  46-47
  2.4 讨论  47-49
3 红花玉兰 AGAMOUS 同源基因的功能鉴定  49-64
  3.1 试验材料  49
    3.1.1 植物材料  49
    3.1.2 菌株和载体  49
    3.1.3 仪器与试剂  49
    3.1.4 培养基与抗生素  49
    3.1.5 引物合成与 DNA 测序  49
  3.2 实验方法  49-57
    3.2.1 MAwuAG 基因表达载体的构建  49-51
    3.2.2 转基因表达载体导入农杆菌  51-52
    3.2.3 农杆菌介导的拟南芥转化  52-53
    3.2.4 拟南芥阳性转化植株的筛选  53
    3.2.5 拟南芥阳性转化苗的 PCR 鉴定  53-55
    3.2.6 拟南芥转基因植株的 Southern 检测  55-57
  3.3 结果与分析  57-62
    3.3.1 MAwuAG 基因导入拟南芥与转基因植株的鉴定  57-60
    3.3.2 红花玉兰 MAwuAG 基因在拟南芥中的异位表达  60-62
  3.4 讨论  62-64
4 红花玉兰及其近源种 AGAMOUS 同源序列的进化分析  64-71
  4.1 试验材料  64
    4.1.1 植物材料  64
    4.1.2 引物合成与 DNA 测序  64
  4.2 方法  64-65
    4.2.1 木兰科植物花芽总 RNA 的提取  64-65
    4.2.2 木兰科植物 AGAMOUS 同源基因的克隆  65
    4.2.3 分子系统发生分析和进化树重建  65
  4.3 结果与分析  65-69
    4.3.1 红花玉兰近缘种 AGAMOUS cDNA 全长克隆  65-67
    4.3.2 分子系统发生分析和进化树重建  67-69
  4.4 讨论  69-71
5 结论与展望  71-73
  5.1 结论  71
  5.2 展望  71-73
参考文献  73-80
后记  80-81
附录  81

红花玉兰MAwuAG基因功能鉴定及其近缘种同源序列进化分析

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