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一株类芽孢杆菌的诱变及其抗真菌活性物质的分离纯化

作　者: 辛磊
导　师: 刘训理
学　校: 山东农业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 多粘类芽孢杆菌紫外诱变活性物质分离纯化
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)Cp-S316是本实验室从泰山土壤中分离获得的一株拮抗细菌(GenBank注册号：AY292989)。该菌株抗菌谱广,对多种动植物病原细菌和真菌都具有良好的抑制或杀灭作用,发酵性状优良,发酵可产生多组分的抗细菌环肽类活性物质,同时也能产生抗真菌的活性物质,而且,发酵配方不同,所产生的两类活性物质的产量差异较大。本实验室已对该菌产生抗真菌活性物质的发酵条件以及发酵配方进行了优化。本试验在前期工作的基础上对Cp-S316野生菌株进行了紫外诱变,获得了抗真菌生物活性较野生菌株高的突变株；对Cp-S316菌株产生的抗真菌活性物质进行了分离纯化与制备,主要结果如下。1、多粘类芽孢杆菌Cp-S316的紫外诱变Cp-S316菌株对紫外线敏感,照射20s时,致死率达到95.3%,选择20s作为最佳诱变时间；通过对诱变菌株的预筛、初筛和复筛,共筛选获得6株发酵液效价明显高于野生菌株的突变株,菌株编号分别为c16、d39、d56、e19、h41、h44,其效价较出发菌株分别提高了1.23倍、1.3倍、1.42倍、1.36倍、1.41倍和1.25倍,连续转接五代,经方差分析,c16、d56、h41、h44前后五代的效价无显著性差异,遗传性稳定。2、抗真菌活性物质的分离纯化与制备选用X-5大孔吸附树脂对活性物质进行吸附,树脂与发酵液的比例为1：20(m／v),静态吸附4h,吸附率为85%；解吸剂为0.01 mol／LHCl-70%乙醇,以解吸剂：树脂=2：1(v:m)动态解吸,解吸率达到82%；甲醇抽提活性物质,回收率为62%；活性物质经CM Sepharose FF离子交换柱层析,0～0.5mol／LNaCl梯度洗脱得到活性物质洗脱峰,收集活性物质经SephadexG25分子筛层析得到活性物质的中间纯化物;利用RP-HPLC进行活性物质的精制,最佳色谱条件为：乙腈：0.1%三氟乙酸水溶液=22：78(v／v)；色谱柱SinoChrom ODS-BP C18柱(4.6×250mm,5μm),流速0.5mL／min,检测波长为210nm,柱温30℃,进样量20μL。按照分析HPLC条件,进行制备色谱,色谱柱为Venusil XBP C18柱(20×250mm),流速为5ml／min,进样量10ml,检测波长为210nm,分离得到保留时间(Rt)分别为14.32min和18.12min的两个抗真菌活性物质组分,对两个组分进行了多次制备,用UPLC检测其纯度,均为单一峰。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章引言  13-27
  1 微生物的诱变育种  13-21
    1.1 物理诱变育种  14-19
      1.1.1 紫外线诱变育种  14-15
      1.1.2 离子束诱变育种  15-16
      1.1.3 空间诱变育种  16-17
      1.1.4 微波诱变育种  17
      1.1.5 激光诱变育种  17-18
      1.1.6 电离辐射诱变育种  18
      1.1.7 超高压诱变育种  18
      1.1.8 其他方法的诱变育种  18-19
    1.2 化学诱变育种  19-20
      1.2.1 烷化剂诱变育种  19
      1.2.2 嵌合剂诱变育种  19
      1.2.3 碱基类似物诱变育种  19
      1.2.4 抗生素诱变育种  19-20
    1.3 生物诱变  20-21
      1.3.1 噬菌体诱变育种  20
      1.3.2 转座因子诱变育种  20
      1.3.3 原生质体诱变育种  20-21
  2 微生物来源的抗真菌抗生素  21-26
    2.1 抑制细胞膜合成的抗生素  22-24
    2.2 抑制细胞壁合成的抗生素  24-25
      2.2.1 脂肽类抗生素(Echinocandin)  24
      2.2.2 Chs抑制剂  24-25
    2.3 抑制蛋白质合成的抗生素  25
    2.4 抑制电子传递的抗生素  25
    2.5 抑制核酸合成的抗生素  25-26
  3 本研究的目的意义  26-27
第二章多粘类芽孢杆菌Cp-S316的紫外诱变  27-34
  1 材料与方法  27-30
    1.1 材料  27
      1.1.1 供试菌株  27
      1.1.2 培养基  27
      1.1.3 主要仪器设备  27
    1.2 方法  27-30
      1.2.1 出发菌株平板菌种的制备  27
      1.2.2 液体种子的制备  27-28
      1.2.3 发酵液效价的生物测定  28-29
        1.2.3.1 指示菌孢子的制备  28
        1.2.3.2 生物活性检测混菌平板的制备  28
        1.2.3.3 效价的生物测定  28-29
      1.2.6 Cp-S316菌株的紫外诱变  29-30
        1.2.6.1 Cp-S316菌株菌悬液的制备  29
        1.2.6.2 紫外线(UV)诱变处理  29
        1.2.6.3 诱变菌株的预筛  29
        1.2.6.4 诱变菌株的初筛  29-30
        1.2.6.5 诱变菌株的复筛  30
      1.2.7 高产菌株的遗传稳定性测定  30
  2 结果与分析  30-33
    2.1 最佳诱变时间  30
    2.2 诱变高产菌株的预筛  30-31
    2.3 诱变高产菌株的初筛  31
    2.4 诱变菌株的复筛  31-32
    2.5 高产突变株的遗传稳定性  32-33
  3 小结  33-34
第三章多粘类芽孢杆菌Cp-S316产生的抗真菌活性物质的分离纯化与制备  34-50
  1 材料与方法  34-38
    1.1 材料  34-35
      1.1.1 菌株  34
      1.1.2 培养基  34
      1.1.3 主要仪器设备  34-35
      1.1.4 主要试验材料  35
    1.2 方法  35-38
      1.2.1 生物活性的检测  35
      1.2.2 Cp-S316抗真菌活性物质的粗提  35-36
        1.2.2.1 抗真菌活性物质发酵液的预处理  35-36
        1.2.2.2 抗真菌活性物质粗物的制备  36
      1.2.3 甲醇抽提抗真菌活性物质  36
      1.2.4 CM Sepharose FF离子交换层析  36-37
      1.2.5 Sephadex G25分子筛层析  37-38
      1.2.6 Cp-S316抗真菌活性物质的精制  38
        1.2.6.1 抗真菌活性物质HPLC检测波长的选择  38
        1.2.6.2 抗真菌活性物质的RP-HPLC色谱条件的选择  38
        1.2.6.3 抗真菌活性物质的半制备高效液相色谱  38
        1.2.6.4 抗真菌活性物质的制备  38
  2 结果与分析  38-48
    2.1 X-5大孔吸附树脂对抗真菌活性物质的吸附解吸结果  38-39
    2.2 甲醇抽提抗真菌活性物质结果  39
    2.3 CM Sepharose FF离子交换层析  39-40
    2.4 Sephadex G25分子筛层析  40
    2.5 抗真菌活性物质的精制  40-48
      2.5.1 抗真菌活性物质紫外光区全扫描结果  40-41
      2.5.2 抗真菌活性物质的RP-HPLC色谱条件  41-43
      2.5.3 抗真菌活性物质的半制备高效液相色谱  43-44
      2.5.4 抗真菌活性物质的制备  44-48
  3 小结  48-50
    3.1 抗真菌活性物质的粗提  48
    3.2 抗真菌活性物质的中间纯化  48
    3.3 抗真菌活性物质的精制  48-50
第四章结论与讨论  50-54
  1 结论  50
    1.1 多粘类芽孢杆菌Cp-S316的紫外诱变  50
    1.2 抗真菌活性物质的分离纯化  50
  2 讨论  50-54
    2.1 关于微生物的诱变育种  50-51
    2.2 关于抗菌物质的分离纯化  51-52
    2.3 关于抗菌物质的结构鉴别  52-54
参考文献  54-60
附录  60-62
致谢  62-63
硕士期间发表论文  63

一株类芽孢杆菌的诱变及其抗真菌活性物质的分离纯化

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