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季也蒙毕赤酵母GZ1菌株嗜杀因子的初步研究

作　者: 贾仁洁
导　师: 王祥红
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 海洋嗜杀酵母 嗜杀因子 β-1,3-D-葡聚糖酶 紫外线-硫酸二已酯复合诱变 最佳发酵条件
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


嗜杀酵母可以产生一类具有抗微生物活性的外毒素，通常把这种外毒素称为嗜杀因子（Killer toxin），它们通常是一些蛋白质或者糖蛋白。嗜杀酵母分泌的外毒素可以抑制或杀死一些敏感菌株，并且对自身分泌的嗜杀因子具有免疫性。研究发现从海洋中分离的海洋嗜杀酵母季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）GZ1菌株对引起梭子蟹“乳化病”的病原酵母WCY具有抑制作用。本实验研究了GZ1菌株的嗜杀因子在不同NaCl浓度（0%，3%，6%，8%）、温度（15，20，25，30℃）、pH（3.0,4.0,4.5,5.0,6.0）值条件下的抑菌效果。该嗜杀因子的最佳作用条件是NaCl浓度0%、pH为4.0，培养温度为15℃。研究了盐度、温度和pH值对海洋嗜杀酵母GZ1菌株发酵产嗜杀因子的影响，结果表明该菌株在温度为20℃，培养基中NaCl含量为0%，pH为4.0时产生嗜杀因子的能力最强。确定了不同培养条件对该菌株产生的β-1,3-葡聚糖酶活性的影响，分别测定了不同培养时间（1d,2d,3d,4d,5d,6d）、不同反应温度（10,20,30,40,50,60℃）不同培养温度（15,20,25,30,35℃）、不同pH（4.0,4.5,5.0,6.0，7.0）、摇瓶装液量250ml三角瓶中装液量分别为（20,30,40,50,60ml）、不同接种量（1,2,3,4,5,6%）对发酵条件的影响以及最佳碳源（葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，甘油，乳糖，玉米粉，麦麸糊精，可溶性淀粉）和最佳氮源（硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，磷酸氢二铵，尿素，牛肉膏，蛋白胨）的确定。实验结果表明最佳培养时间为3d、最佳反应温度是40℃、最佳培养温度为20℃、最适pH为4.0时酶活最大、250ml三角瓶中的最佳装液量为30ml、最佳接种量为3%时酶活最大、最佳碳源为葡萄糖、最佳氮源为蛋白胨。本实验通过紫外线-硫酸二乙酯复合诱变筛选出一株抑菌能力较强并且遗传性状稳定的的菌株，抑菌能力提高了22.7%、经过复筛后该诱变菌株的β-1,3-葡聚糖酶酶活提高了17.8%。进一步测定了通过紫外线-硫酸二乙酯复合诱变筛选出的抑菌能力较强并且遗传性状稳定的菌株在发酵罐中的最佳发酵条件，研究了转速（100,150，200,250rpm）、温度（15,20,25,30,35℃）、不同起始pH（3.0,4.0,5.0,6.0,7.0）值对发酵条件的影响。实验结果表明在发酵罐中的最佳发酵条件为转速200rpm、发酵温度为20℃、起始pH值为4.0时的β-1,3-葡聚糖酶酶活最高。嗜杀酵母GZ1菌株产生的β-1,3-葡聚糖酶经DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换和Sephadex G75凝胶过滤得到纯化，经过SDS-PAGE测定得到了分子量为47.5kDa的单一条带。纯化后的β-1,3-葡聚糖酶仍然具有抑菌活性，这表明该菌株产生的β-1,3-葡聚糖酶和嗜杀因子是同一种物质。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章 绪论  13-33
  1 海洋酵母菌概述  13-16
    1.1 产纤维素酶的海洋酵母菌  14-15
    1.2 产菊糖酶的海洋酵母菌  15
    1.3 产辅酶 Q10 的海洋酵母菌  15-16
    1.4 产淀粉酶的海洋酵母菌  16
    1.5 产嗜杀因子的海洋酵母菌  16
  2 海洋环境中酵母菌的分布和生物多样性  16-19
    2.1 海洋酵母菌的生理特性  16-17
    2.2 海洋酵母菌的分布和种类  17-18
    2.3 海洋环境中的致病酵母菌  18-19
  3 嗜杀因子和嗜杀酵母菌  19-25
    3.1 自然界中的嗜杀现象  19
    3.2 嗜杀酵母的种类  19-20
    3.3 嗜杀因子的性质  20-24
    3.4 嗜杀因子的作用机理  24-25
  4 嗜杀酵母菌的应用  25-27
    4.1 嗜杀酵母在发酵、食品、农业、养殖等方面工业中的应用  25-27
    4.2 嗜杀因子可以作为潜在的抗真菌药物  27
    4.3 一些嗜杀酵母在转基因植物中的应用  27
    4.4 一些嗜杀母菌在抗水果蔬菜腐烂中的应用  27
  5 嗜杀酵母的应用前景  27-28
  6 β-1,3-葡聚糖酶  28-29
    6.1 β-1,3-葡聚糖酶的分布  28-29
    6.2 β-1,3-葡聚糖酶的特点  29
  7 诱变育种  29-31
    7.1 诱变育种的方法  29-31
    7.2 诱变育种的应用前景和进展  31
  8 论文的技术路线  31-33
第二章 海洋嗜杀酵母的筛选  33-39
  1 前言  33
  2 实验材料与方法  33-34
    2.1 海洋酵母菌菌种  33
    2.2 培养基  33-34
    2.3 嗜杀酵母的筛选  34
  3 结果与讨论  34-38
    3.1 海洋嗜杀酵母菌的筛选结果  34-37
    3.2 一些海洋嗜杀酵母的菌落形态特征  37-38
  4 讨论  38
  5 本章小结  38-39
第三章 嗜杀酵母菌 GZ1 最佳作用条件的的确定  39-45
  1 前言  39
  2 实验材料与方法  39-40
    2.1 酵母菌菌种  39
    2.2 培养基  39
    2.3 嗜杀酵母最佳抑菌条件的确定  39-40
  3 实验结果  40-44
    3.1 不同盐度，培养温度以及 pH 值条件下嗜杀酵母 GZ1 的抑菌效果  40-44
  4 讨论  44
  5 本章小结  44-45
第四章 海洋嗜杀酵母 GZ1 嗜杀因子的发酵条件与嗜杀因子最佳作用条件研究  45-55
  1 前言  45-46
  2 实验材料与方法  46-47
    2.0 实验所用菌种  46
    2.1 培养基  46
    2.2 嗜杀酵母嗜杀活性检测培养基成分  46
    2.3 嗜杀酵母 GZ1 菌株的发酵培养基  46-47
    2.4 嗜杀酵母发酵液的制备  47
    2.5 嗜杀因子的浓缩  47
    2.6 嗜杀因子抑菌活性检测  47
  3 实验结果与讨论  47-54
    3.1 不同温度、盐度及 pH 值对嗜杀因子的抑菌效果的影响  47-50
    3.2 温度、盐度和 pH 值对菌株 GZ1 发酵产生嗜杀因子的影响  50-54
  4 讨论  54
  5 本章小结  54-55
第五章 不同发酵条件对 GZ1 菌株产β-1,3-葡聚糖酶的影响  55-66
  1 前言  55-56
  2 实验材料与方法  56-59
    2.1 实验所用菌种  56
    2.2 培养基  56-57
    2.3 标准曲线的制作  57
    2.4 嗜杀酵母菌 GZ1 的培养  57-58
    2.5 β-1,3-葡聚糖酶粗酶浓缩液的制备  58
    2.6 测定β-1,3-葡聚糖酶活性  58
    2.7 不同培养时间对β-1,3-葡聚糖酶活力的影响  58
    2.8 不同 pH 值对β-1,3-葡聚糖酶活的影响  58
    2.9 不同反应温度对β-1,3-葡聚糖酶活的影响  58
    2.10 摇瓶装液量对β-1,3-葡聚糖酶酶活的影响  58-59
    2.11 接种量对β-1,3-葡聚糖酶酶活的影响  59
    2.12 不同碳源对菌株产β-1,3-葡聚糖酶的影响  59
    2.13 不同氮源对菌株产葡聚糖酶的影响  59
  3 实验结果与讨论  59-64
    3.1 不同培养时间对β-1,3-葡聚糖酶活力的影响  59-60
    3.2 不同 pH 值对β-1,3-葡聚糖酶活的影响  60-61
    3.3 不同反应温度对β-1,3-葡聚糖酶活的影响  61
    3.4 摇瓶装液量对β-1,3-葡聚糖酶酶活的影响  61-62
    3.5 接种量对β-1,3-葡聚糖酶酶活的影响  62
    3.6 不同碳源对菌株产β-1,3-葡聚糖酶的影响  62-63
    3.7 不同氮源对菌株产葡聚糖酶的影响  63-64
  4 讨论  64-65
  5 小结  65-66
第六章 嗜杀酵母 GZ1 的诱变育种及发酵罐最佳产酶条件的确定  66-76
  1 前言  66-67
  2 实验材料与方法  67-69
    2.1 菌种  67
    2.2 培养基  67
    2.3 试剂  67-68
    2.4 紫外线诱变  68
    2.5 硫酸二乙酯诱变  68-69
    2.6 发酵罐转速对发酵产酶的影响  69
    2.7 发酵罐温度对发酵产酶的影响  69
    2.8 不同起始 pH 值对发酵产酶的影响  69
  3 实验结果与讨论  69-74
    3.1 紫外线诱变结果  69-70
    3.2 硫酸二乙酯诱变结果  70-71
    3.3 发酵罐转速对发酵产酶的影响  71-72
    3.4 发酵罐温度对发酵产酶的影响  72
    3.5 不同起始 pH 值对发酵产酶的影响  72-74
  4 讨论  74-75
  5 本章小结  75-76
第七章 海洋嗜杀酵母菌 GZ1 的β-1,3-葡聚糖酶的纯化  76-87
  1 前言  76
  2 实验材料与方法  76-82
    2.1 菌种  76-77
    2.2 培养基  77
    2.3 试剂  77-78
    2.4 总蛋白含量的测定  78-79
    2.5 测定β-1,3-葡聚糖酶活性  79
    2.6 β-1,3-葡聚糖酶粗酶浓缩液的制备  79
    2.7 SephadexG-75 凝胶过滤  79-80
    2.8 DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换的方法  80-81
    2.9 不连续 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  81-82
  3 实验结果与讨论  82-85
    3.1 嗜杀因子的纯化  82-83
    3.2 嗜杀因子分子量的测定  83-84
    3.3 海洋嗜杀酵母 GZ1 纯化的β-1,3-葡聚糖酶的嗜杀活性  84-85
  4 讨论  85-86
  5 本章小结  86-87
全文总结  87-88
论文的创新点与展望  88-89
参考文献  89-93
致谢  93-94
在学期间发表的学术论文  94

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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