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耐冷海洋嗜杀酵母Mrakia frigida嗜杀因子的研究

作　者: 华明夏
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 耐冷酵母菌 木拉克酵母 病原酵母菌 嗜杀因子 嗜杀机理
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


嗜杀因子（Killer toxin）是许多酵母菌可以产生的一些具有抗微生物活力的外毒素。它们通常是蛋白质或糖蛋白，能够杀死同种或亲缘关系比较近的酵母菌、丝状真菌或细菌。能够产生嗜杀因子的酵母菌称作为嗜杀酵母（Killer yeasts），它们自己对所产的毒素具有免疫性；被杀死的酵母菌称为敏感菌株。本论文从南极海泥样品中筛选到一株高嗜杀活性的耐冷菌株2E00797，通过常规鉴定和分子鉴定的方法鉴定为寒冷木拉克酵母（Mrakia frigida），这是在南极海泥样品中分离到的耐冷嗜杀酵母具有强嗜杀活性的首次报道。M. frigida2E00797菌株能杀死梭子蟹致病菌梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata WCY）和人类条件致病菌白色假丝酵母菌（Candida albicans）。本研究优化的M. frigida2E00797菌株嗜杀因子的最佳发酵条件为：在15°C下，以pH4.5、含NaCl3.0%(w/v)的YPD为培养基培养4d。发酵液上清经过透析、DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子柱交换、超滤浓缩收集液、SephadexTMG-75凝胶过滤最终得到纯化的嗜杀因子，SDS-PAGE显示其分子量约为55.6kDa。纯化的嗜杀因子在15°C，pH为4.5，含NaCl3.0%(w/v)的嗜杀平板上检测，嗜杀活力最高。经过质谱分析，纯化的嗜杀因子与蛋白激酶的相似性最高，达到35.1%。对M. frigida2E00797菌株嗜杀因子的嗜杀机理进行初步探究，结果发现嗜杀因子可以杀死完整的敏感酵母WCY，却不能杀死WCY的原生质体，说明嗜杀因子的结合位点存在于敏感酵母的细胞壁；电镜检测发现经嗜杀因子处理过的WCY细胞壁裂解，说明该嗜杀因子能破坏敏感酵母细胞壁的完整；荧光检测发现经嗜杀因子处理过的WCY和C. albicans细胞可以被染料PI染成红色，说明该嗜杀因子能破坏敏感酵母WCY和C. albicans的通透性。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 绪论  10-26
  1 低温微生物的研究概述  10-14
    1.1 冷适应微生物的生物多样性  10-11
    1.2 微生物的适冷机制  11-14
  2 嗜杀因子  14-24
    2.1 嗜杀因子简介  14-15
    2.2 产嗜杀因子的海洋酵母菌  15-16
    2.3 嗜杀因子的特性  16-18
    2.4 嗜杀作用机理  18-22
    2.5 嗜杀活力测定方法  22-23
    2.6 嗜杀因子的应用  23-24
  3 本论文的研究内容及意义  24-26
第二章 高嗜杀活性南极菌株的筛选及鉴定  26-37
  1 前言  26-27
  2 材料与方法  27-30
    2.1 菌株  27
    2.2 培养基与试剂  27-28
    2.3 实验方法  28-30
  3 结果与讨论  30-36
    3.1 高嗜杀活性嗜杀酵母的菌种筛选  30-31
    3.2 嗜杀酵母 2E00797 菌株的鉴定结果  31-35
    3.3 M. frigida 2E00797 的杀菌谱  35-36
  4 本章小结  36-37
第三章 M. frigida 2E00797 菌株嗜杀因子发酵条件及活性检测条件的优化  37-46
  1 前言  37
  2 材料与方法  37-39
    2.1 菌株  37
    2.2 培养基与试剂  37-38
    2.3 实验方法  38-39
  3 结果与讨论  39-45
    3.1 嗜杀酵母 M. frigida 2E00797 最适生长温度的测定  39-40
    3.2 产嗜杀因子发酵条件的优化  40-43
    3.3 嗜杀因子嗜杀活性检测条件的优化  43-45
  4 本章小结  45-46
第四章 M. frigida 2E00797 菌株嗜杀因子的纯化及性质研究  46-59
  1 前言  46
  2 材料与方法  46-50
    2.1 菌株  46
    2.2 培养基与试剂  46-47
    2.3 实验方法  47-50
  3 结果与讨论  50-58
    3.1 M. frigida 2E00797 菌株嗜杀因子的分离纯化  50-52
    3.2 M. frigida 2E00797 菌株嗜杀因子的特性  52-58
  4 本章总结  58-59
第五章 M. frigida 2E00797 菌株嗜杀因子嗜杀机理的初步研究  59-69
  1 前言  59
  2 材料与方法  59-62
    2.1 菌株  59
    2.2 培养基与试剂  59-61
    2.3 实验方法  61-62
  3 结果与讨论  62-67
    3.1 嗜杀因子对敏感酵母 WCY 细胞原生质体的嗜杀活性影响  62-63
    3.2 嗜杀因子水解多糖能力的测定  63
    3.3 多糖的吸附对纯化的嗜杀因子嗜杀活性的影响  63-64
    3.4 电镜检测嗜杀因子作用的敏感酵母细胞 WCY  64
    3.5 荧光检测嗜杀因子作用的敏感酵母细胞 WCY 和 C. albicans  64-67
  4 本章小结  67-69
论文的总结与创新点  69-70
参考文献  70-76
附录：英文缩写符号及其中英文名称  76-77
致谢  77-78
硕士发表的学术论文  78

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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