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深色有隔内生真菌（DSE）抗锌菌株的筛选及其抗性机理的初步研究

作　者: 刁玉华
导　师: 赵之伟; 李涛
学　校: 云南大学
专　业: 微生物学
关键词: 深色有隔内生真菌(DSE) 锌 吸附与积累 抗氧化系统
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


随着工业、采矿业的快速发展,导致了大量含重金属废水、废渣的产生,对环境造成严重污染。在重金属污染治理时,如何降低或消除重金属的毒性是减少重金属污染危害的关键。自然界中许多菌具有重金属抗性和富集能力,因而用微生物法治理重金属污染具有较好的前景。深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes, DSE)是一类种类组成和生态学功能都多样的、定殖于植物根部的小型内生真菌,它们广泛分布于各种受胁迫的生态系统中,是一类可能具有与菌根真菌相似生态学功能的内生真菌。本论文以分离自云南不同生境中的土著菌株为菌种材料,首先对菌株进行了极限值法筛选抗性与敏感菌株,然后,对试验菌株进行了形态学和分子生物学技术的初步鉴定及其半效应浓度值(median effect concentration, EC50)的测定。比较性地探讨了纯培养条件下,DSE对锌的吸附与积累特性。在此基础上,进一步研究了不同浓度锌胁迫条件对两株菌自身抗氧化系统的影响。取得如下结果：1.采用极限值筛选法,从云南不同生境中分离得到的225株根内生真菌中筛选得到,抗性菌一株H93,敏感菌一株B40-3；结合两株菌的形态学和分子序列,H93定为嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila),B40-3不产孢子,根据分子序列暂定为一种外瓶霉属真菌(Exophiala sp.)。两株菌对锌的ECso值测定发现：H93为1010mg/L Zn(II), B40-3为26mg/LZn(II),两者相差39倍。说明它们的锌抗性存在很大差异。2.对影响两株菌吸附效率的条件,如溶液初始pH值、重金属初始浓度、吸附剂加入量、吸附时问等进行了对比研究。实验结果表明,两株菌的吸附过程均主要是以细胞壁吸附为主的物理过程。两株菌的最佳吸附条件为：pH5.5, Zn(II)初始浓度为100mg/L,菌丝体的加入量为5g/L和最佳吸附时间为60min,同时两株菌在相同条件下吸附效率没有太大的差异。Zn(Ⅱ)积累实验研究发现两株菌主要以细胞内积累为主,在ECso条件下,H93的细胞壁吸附与细胞内积累量分别是B40-3的2.52和5.24倍,说明了抗性菌株具有较高的富集能力。3.抗性菌株H93和敏感菌株B40-3对Zn(Ⅱ)抗性机制初步研究表明,高浓度的Zn(Ⅱ)显著抑制了H93和B40-3的生长,导致可溶性蛋白含量下降,还原型谷胱甘肽(glutathion, GSH)含量显著增加,说明GSH具有缓解重金属对细胞的氧化损伤作用；且超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(peroxidase, POD)活性随重金属浓度增加显著增加,H93的酶活性增加较大,进一步表明H93对Zn(Ⅱ)的抗性较B40-3强。Zn(Ⅱ)作用时,可诱导H93和B40-3菌体丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增加,说明活性氧自由基介导的膜质过氧化作用是Zn(Ⅱ)导致H93和B40-3细胞损伤的主要原因。上述研究结果表明,分类学上同属的DSE菌株间对Zn(Ⅱ)的抗性存在较大差异,其中有抗性菌株和敏感菌株,本文所获得的抗性和敏感菌株为进一步研究DSE对Zn(Ⅱ)的抗性机理提供了菌种保障；Zn(Ⅱ)可在DSE细胞壁积累,其过程为单纯的物理过程,同时抗性菌株也可以将Zn(Ⅱ)吸收积累到细胞内,细胞质中过量的Zn(Ⅱ)导致细胞可溶性蛋白含量下降,进而MDA含量增加(造成细胞损伤)；而抗氧化物质(GSH)含量增加,抗氧化酶(SOD, POD)活性升高又可能是DSE生理解毒的重要途径。这些研究结果和结论为进一步深入研究DSE菌株对Zn(Ⅱ)的抗性提供了基本资料和研究线索。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 文献综述  11-17
  1. 深色有隔内生真菌(DSE)的研究进展  11-12
  2. 微生物的富集特性研究  12-14
  3. 微生物对重金属的抗性机制研究  14-15
  4. 本文的研究内容及技术路线  15-17
第二章 抗性菌株筛选与鉴定  17-33
  1. 材料和方法  17-27
    1.1 菌种与培养基  17
    1.2 DSE抗性菌株与敏感菌株的筛选  17-18
    1.3 菌株的半效应浓度值(EC_(50))测定  18
    1.4 菌株的鉴定  18-27
  2. 结果  27-31
    2.1 DSE的筛选结果  27-28
    2.2 菌株的半效应浓度值(EC_(50))测定  28
    2.3 菌株的形态学描述  28
    2.4 菌株的分子鉴定结果  28-31
  3. 讨论  31-33
第三章 两株外瓶霉菌株对Zn(Ⅱ)的富集特性研究  33-43
  第一节 不同条件对两株菌吸附Zn(Ⅱ)的影响  33-40
    1. 材料与方法  33-35
      1.1 菌株与培养基  33
      1.2 培养方法  33-34
      1.3 菌株H93与B40-3对Zn(Ⅱ)的吸附试验  34
      1.4 测定方法  34-35
      1.5 数据分析  35
    2. 结果  35-38
      2.1 pH值对DSE菌株吸附Zn(Ⅱ)的影响  35-36
      2.2 Zn(Ⅱ)初始浓度对DSE菌株吸附Zn(Ⅱ)的影响  36
      2.3 菌丝体加入量对DSE菌株吸附Zn(Ⅱ)的影响  36-37
      2.4 吸附时间对DSE菌株吸附Zn(Ⅱ)的影响  37-38
    3. 讨论  38-40
  第二节 两株外瓶霉菌株对Zn(Ⅱ)积累特性研究  40-43
    1. 材料与方法  40
      1.1 菌株与培养基  40
      1.2 培养方法  40
      1.3 菌体H93和B40-3积累特性实验  40
      1.4 测定方法  40
      1.5 数据分析  40
    2. 结果  40-42
    3. 讨论  42-43
第四章 两株外瓶霉菌株对Zn(Ⅱ)抗性机制的初步研究  43-52
  1. 材料和方法  43-46
    1.1 菌株与培养基  43
    1.2 培养方法  43
    1.3 菌丝的制备  43-44
    1.4 Zn(Ⅱ)对抗氧化系统的影响  44-46
    1.5 数据分析  46
  2. 结果  46-50
    2.1 不同浓度Zn(Ⅱ)对菌体的生长影响  46
    2.2 不同浓度Zn(Ⅱ)对菌体可溶性蛋白含量的影响  46-47
    2.3 不同浓度Zn(Ⅱ)对菌体SOD活性的影响  47-48
    2.4 不同浓度Zn(Ⅱ)对菌体POD活性的影响  48-49
    2.5 不同浓度Zn(Ⅱ)对菌体GSH含量的影响  49-50
    2.6 不同浓度Zn(Ⅱ)对菌体MDA含量的影响  50
  3. 讨论  50-52
参考文献  52-60
附录  60-64
  附录一： 论文中所用试剂、培养基的配制  60-61
  附录二： 论文中使用的缩写词及中英文对照  61-63
  附录三： 在读期间发表的论文  63-64
致谢  64

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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