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长期不同施肥处理对反硝化菌群落结构及功能的影响

作　者: 尹昌
导　师: 梁永超; 范分良
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物营养与肥料
关键词: 旱地 nirK nirS nosZ 反硝化菌 T-RFLP
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


作为农田氮肥损失的重要途径和温室气体N2O排放的重要来源，农田反硝化作用研究受到越来越多的关注，然而目前只有有限的报道是关于不同施肥处理对旱地反硝化菌种群影响机制的研究。为探索长期不同施肥处理对旱地反硝化作用影响的微生物分子生态机制，采集哈尔滨（HEB）、公主岭（GZL）和沈阳（SY）等三处长期定位试验点的土壤，采用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术，结合土壤反硝化潜势（DEA）和理化性质的测定，研究了长期不同施肥处理对东北旱地土壤nirK、nirS和nosZ型反硝化菌群落结构的影响。三处试验点皆设不施肥（CK）、单施有机肥（OM）、单施无机肥（NPK）和有机和无机肥混施（MNPK）等4个处理。结果如下：1)OM处理显著增加了公主岭和沈阳的DEA，而对哈尔滨的DEA无显著影响；NPK处理显著降低了哈尔滨和沈阳的DEA，对公主岭的DEA无显著影响；除公主岭的MNPK处理显著增加了土壤的DEA外，在哈尔滨和沈阳，MNPK处理对土壤DEA无显著影响。2)哈尔滨及沈阳的NPK和MNPK处理改变了nirK型反硝化菌的群落结构，且NPK和MNPK处理的群落结构相似，OM处理对nirK型反硝化菌群落结构影响较小；在公主岭OM和MNPK处理显著改变了nirK型反硝化菌的群落结构，而NPK和CK处理的群落结构相似。系统发育分析表明，三个地点的大多数nirK克隆序列与土壤中未培养的反硝化细菌相似度较高，在三个地点施肥处理中显著变化的片段长度集中分布在进化树的一个大簇内。相关性分析表明，在哈尔滨，除Corg/N外，有机质（OM）、全氮（TN）、含水量（Moisture）、Corg/P、全磷（P）、速效磷（OlsenP）和pH依次与nirK型反硝化菌群落结构的变化显著相关（r=0.3230.789，P<0.05），DEA与群落结构的变化不相关；在公主岭，除含水量、Corg/N、Corg/P和DEA外，环境因子依P、OlsenP、有机质（OM）、TN和pH与群落结构的变化显著相关（r=0.4610.657，P<0.05）；在沈阳只有DEA和pH与群落结构的变化显著相关（r=0.3350.455，P<0.05）；综合分析显示除Moisture外，其余指标皆与地点间的群落结构差异显著相关（r=0.1280.604，P<0.05）。3)哈尔滨及沈阳的NPK和MNPK处理显著改变了nirS型反硝化菌的群落结构，OM与CK处理的群落结构相似；公主岭的OM和MNPK处理显著改变了nirS型反硝化菌的群落结构，NPK处理对群落结构无显著影响。系统发育分析显示多数的nirS克隆序列与已培养的微生物相似度较低，但与来自土壤中的nirS序列相似度较高，三个地点中施肥处理显著改变的部分片段长度位于进化树相近位置，但施肥影响的大多数片段长度所代表的反硝化菌并不一致。相关性分析显示，在哈尔滨，除C/N、有机质（OM）和DEA外，C/P、含水量、TN、P、Olsen P和pH依次与群落结构的变化显著相关（r=0.2630.55，P<0.05）；在公主岭，除含水量和Corg/N外，DEA、TN、Olsen P、有机质（OM）、P和pH与群落结构的变化显著相关（r=0.3810.836，P<0.05）；在沈阳只有Olsen P和pH与群落结构的变化显著相关（r=0.2550.511，P<0.05）；综合分析显示，全部指标皆与地点间的群落结构差异显著相关（r=0.0780.350，P<0.05）。4)哈尔滨和沈阳的NPK和MNPK处理显著改变了nosZ型反硝化菌的群落结构，OM处理对哈尔滨和沈阳nosZ型反硝化菌的群落结构影响较小；公主岭的OM和MNPK处理显著改变了nosZ型反硝化菌的群落结构，而NPK处理无明显影响。系统发育显示，多数的nosZ克隆序列属于α-变形菌纲（α-proteobacteria）的根瘤菌目（Rhizobiales），三个地点中对施肥显著响应的片段长度代表的反硝化菌一致。相关性分析显示，在哈尔滨，除DEA和Corg/N外，有机质（OM）、TN、Moisture、Corg/P、P、pH和Olsen P与群落结构的变化显著相关（r=0.3070.734，P<0.05）；在公主岭，除Corg/N和Moisture外，Corg/P、DEA、P、TN、pH、Olsen P和有机质依次与nosZ型反硝化菌群落结构的变化显著相关（r=0.4900.703，P<0.05）；在沈阳，除DEA、Moisture和Corg/N外，TN、Corg/P、有机质（OM）、P、Olsen P和pH依次与群落结构的变化显著相关；综合分析显示，全部指标皆与地点间的nosZ型反硝化菌群落结构显著差异相关（r=0.0930.470，P<0.05）。综上所述，本研究表明，长期不同施肥处理影响了nirK、nirS和nosZ型反硝化菌的群落结构和活性，群落结构对施肥处理响应的模式依地点的不同而不同，土壤pH和Olsen P的变化是导致三种类型反硝化菌群落结构改变的主要原因，且三种类型反硝化菌对土壤理化性质变化的敏感程度不同。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-14
第一章 文献综述  14-25
  1.1 反硝化菌种群分子生态研究进展  14-18
    1.1.1 参与反硝化的微生物和酶  14-15
    1.1.2 反硝化菌种群的系统发育学研究  15-16
    1.1.3 反硝化菌种群结构与功能的研究  16-17
    1.1.4 反硝化菌种群丰度与功能的研究  17-18
  1.2 反硝化菌种群动态研究中的常用技术  18-20
    1.2.1 DGGE 技术在反硝化菌种群动态研究中的应用  18-19
    1.2.2 T-RFLP 技术在反硝化菌种群动态研究中的应用  19-20
  1.3 环境中的反硝化菌种群  20-23
    1.3.1 反硝化菌的地域分布  20-21
    1.3.2 影响反硝化菌种群的土壤环境因子  21-22
    1.3.3 农田反硝化菌分子生态研究现状  22-23
  1.4 研究背景和主要研究内容  23-24
    1.4.1 研究背景  23
    1.4.2 研究内容和目的  23-24
  1.5 技术路线  24-25
第二章 材料与方法  25-31
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 供试土壤  25-26
    2.1.2 样品的采集和处理  26
  2.2 实验方法  26-29
    2.2.1 土壤基本理化性质的测定  26
    2.2.2 DEA 的测定  26
    2.2.3 主要试剂的配制  26-27
    2.2.4 土壤微生物总 DNA 的提取  27-28
    2.2.5 PCR 扩增  28
    2.2.6 PCR 产物切胶纯化和回收  28
    2.2.7 酶切、纯化及 T-RFLP 分析  28-29
    2.2.8 克隆  29
    2.2.9 菌落 PCR 检验阳性克隆  29
  2.3 数据分析  29-31
    2.3.1 序列分析  29-30
    2.3.2 相关性分析  30-31
第三章 长期不同施肥对土壤理化性质和 DEA 的影响  31-35
  3.1 引言  31
  3.2 实验结果  31-33
    3.2.1 长期不同施肥对土壤理化性质的影响  31-32
    3.2.2 长期不同施肥对 DEA 的影响  32
    3.2.3 土壤理化性质与 DEA 的相关性  32-33
  3.3 讨论  33-35
第四章 长期不同施肥对 nirK 型反硝化菌群落结构的影响  35-47
  4.1 引言  35
  4.2 实验结果  35-45
    4.2.1 长期不同施肥对 nirK 型反硝化菌群落结构的影响  35-37
    4.2.2 nirK 基因系统发育分析  37-43
    4.2.3 nirK 型反硝化菌群落结构与土壤理化性质及 DEA 的相关性  43-45
  4.3 讨论  45-47
第五章 长期不同施肥对 nirS 型反硝化菌群落结构的影响  47-61
  5.1 引言  47
  5.2 实验结果  47-58
    5.2.1 长期不同施肥对 nirS 型反硝化菌群落结构的影响  47-49
    5.2.2 nirS 基因系统发育分析  49-56
    5.2.3 nirS 型反硝化菌群落结构与土壤理化性质及 DEA 的相关性  56-58
  5.3 讨论  58-61
第六章 长期不同施肥对 nosZ 型反硝化菌群落结构的影响  61-74
  6.1 引言  61
  6.2 实验结果  61-72
    6.2.1 不同施肥对 nosZ 型反硝化菌群落结构的影响  61-63
    6.2.2 nosZ 基因系统发育分析  63-70
    6.2.3 nosZ 反硝化细菌群落结构与土壤理化性质及 DEA 的相关性  70-72
  6.3 讨论  72-74
第七章 综合讨论  74-77
第八章 全文结论与展望  77-78
  8.1 全文结论  77
  8.2 展望  77-78
参考文献  78-85
致谢  85-86
作者简历  86

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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