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偶氮染料脱色细菌的脱色特性及偶氮还原机理的研究

作　者: 崔岱宗
导　师: 赵敏
学　校: 东北林业大学
专　业: 微生物学
关键词: 偶氮染料细菌脱色偶氮还原酶介体微生物菌群分析
分类号: X703
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

偶氮染料是目前种类最多的一大类染料。在生产和应用的过程中,约有10%-15%的染料未经处理即被排放到环境中去并可能严重影响接触者的健康。因此,偶氮废水必需在排放前进行无害化处理。目前,已有多种处理偶氮废水的方法,其中微生物脱色法被认为是最为有效且对环境无害的方法。本研究的目的是从长期受到偶氮染料污染的环境中筛选分离出具有高效降解偶氮染料能力的菌株,考察其对偶氮染料的脱色特性,并研究各种因素对偶氮染料脱色的影响,为相关菌株的工业应用提供技术参数。研究在好氧条件下和厌氧条件下染料的降解机制,深入探讨偶氮还原酶的作用机理。培育出对环境无害、抗逆性强、对偶氮染料具有较高降解效率的混合菌群,并比较好氧和厌氧降解菌群结构的异同。本论文具体的研究结果如下：(1)本研究在污染的土壤样品中成功的分离到一株可在厌氧条件下降解偶氮染料的菌株Y3。经鉴定后,发现该菌株属于肺炎克雷伯氏菌。菌株Y3可在16h内完全降解100mg/L的甲基红,表明其具有很高的偶氮降解能力。对菌株Y3的染料降解特性的研究显示,该菌株可在25-45℃、pH值为4-9及盐度为1%-4%的条件下有效降解偶氮染料。该菌株可以以甲基红为唯一碳源及能源物质进行生长并使其降解。菌株Y3可对多种不同结构的偶氮染料进行降解,并能耐受较高的染料浓度。植物毒理实验表明经Y3处理后的偶氮废水毒性大大降低,然而,紫外—可见光谱分析显示菌株Y3并不能使偶氮染料完全矿化,而是使染料降解为无色的中间产物。(2)采用与厌氧筛选相似的实验方法,本研究从染料废水中分离了一株好氧偶氮降解菌。染料降解实验表明,该菌株可在好氧条件下,有效降解不同结构的偶氮染料,且对各种理化因素均具有良好的耐受性。经鉴定该菌株为大肠杆菌,并将其定名为E.coli CD-2。对该菌株细胞内的偶氮还原酶进行纯化,经质谱鉴定后,发现该酶的序列与大肠杆菌K12醌还原酶的序列具有较高的同源性。酶活检测显示,该还原酶同时具有偶氮还原酶及醌还原酶的活性。结合之前的其它研究成果,本研究提出观点：细菌细胞中可能并不存在专门降解偶氮染料的特异性还原酶。偶氮键的断裂可能是由一些原本在细菌细胞内催化重要生化反应的还原酶非特异性催化的。然而,打开偶氮键并不是这类酶在细胞中的单一功能,甚至不是主要功能。本研究对该酶的性质做了较为深入的研究,结果表明,该酶在细胞外仍具有良好的偶氮染料降解能力,且在较宽范围的pH、温度及盐度等理化条件下维持良好的稳定性。以上特性使该酶有很大潜力应用于日后的偶氮染料降解工业用酶的开发中。对酶的降解产物进行高效液相色谱分析后表明,该酶可以通过NADH所提供的H离子打开偶氮键,使染料脱色,形成的中间代谢产物则可能需要细胞内其它酶的参与从而达到彻底降解。(3)本研究测定了在好氧条件下,蒽醌类化合物对菌株CD-2降解偶氮染料效率的影响。结果表明,蒽醌介体可以大幅提高菌株CD-2的好氧偶氮降解效率。基于此,本研究认为,好氧体系中存在蒽醌介体时,菌株对偶氮染料的降解可能不再是一个特异性的酶促反应。蒽醌介体可以加速电子从还原剂传递到偶氮染料的速度,从而使偶氮染料的降解速率加快。虽然介体可以显著提高细菌细胞对偶氮染料的降解速率,但当细胞破碎后,介体并不再直接对偶氮染料的降解起促进作用。该结果表明,细菌完整的细胞膜阻碍了偶氮染料与细胞内还原酶接触的机会,而蒽醌介体起到了电子的跨膜传递作用。因此,在有介体存在的情况下,偶氮还原速率得到提高。而当细胞破碎后,细胞质中的还原酶可以与染料直接接触,葸醌介体的电子传递作用即不再重要。(4)本研究利用不断加强偶氮染料筛选强度的方法,成功的从环境中培育出可分别在好氧和厌氧条件下降解偶氮染料的混合菌群,通过对混合菌群降解特性的研究发现,在相同条件下,混合菌群降解偶氮染料的效果要好于纯菌株。厌氧菌群的降解效果略好于好氧菌群。利用传统的平板划线分离的方法对两个混合菌群中的菌株进行分离,结果表明,在菌群中分离的13株细菌均为肠杆菌科的兼性厌氧细菌。对两个菌群的PCR-DGGE分析显示,随着甲基红浓度的逐渐升高,混合菌群的结构出现明显变化。当菌群稳定时,对DGGE条带进行测序分析后表明,好氧菌群中所包含的降解菌分别属于克雷伯氏属、布丘菌属和芽孢杆菌属；厌氧菌群中的主要细菌则属于克雷伯氏属、埃希菌属、芽孢杆菌属和梭菌属。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-19
1 绪论  19-30
  1.1 偶氮染料简介  19
    1.1.1 染料的种类  19
    1.1.2 偶氮染料的概念  19
  1.2 偶氮染料的危害  19-20
  1.3 偶氮废水的特点  20
  1.4 偶氮废水的处理方法  20-22
    1.4.1 物理法  20-21
    1.4.2 化学法  21
    1.4.3 生物法  21-22
  1.5 细菌对偶氮染料的降解  22-23
    1.5.1 好氧条件下细菌对偶氮染料的降解  22
    1.5.2 厌氧条件下细菌对偶氮染料的降解  22-23
  1.6 细菌偶氮还原的机理  23-25
    1.6.1 有氧条件下细菌的偶氮还原机理  23-24
    1.6.2 厌氧条件下细菌的偶氮还原机理  24-25
  1.7 氧化还原介体对偶氮染料的强化脱色  25-26
  1.8 细菌降解偶氮染料的影响因素  26-27
    1.8.1 环境因子对偶氮染料降解的影响  26-27
    1.8.2 染料浓度及结构对细菌脱色的影响  27
    1.8.3 电子供体的影响  27
  1.9 变性梯度凝胶电泳技术在微生物生态研究中的应用  27-28
    1.9.1 DGGE技术原理  28
    1.9.2 DGGE技术的应用  28
  1.10 本研究的目的与意义  28-29
  1.11 本研究的主要内容  29-30
2 厌氧偶氮染料降解菌的筛选及降解特性研究  30-47
  2.1 实验材料与仪器  30-31
    2.1.1 材料  30
    2.1.2 生化试剂  30
    2.1.3 实验仪器  30-31
  2.2 试剂配制  31-32
  2.3 实验方法  32-37
    2.3.1 甲基红降解菌株的筛选  32
    2.3.2 菌株的鉴定  32-35
    2.3.3 菌体生长曲线及染料降解曲线测定  35
    2.3.4 温度对菌体生长及染料降解的影响  35
    2.3.5 pH值对菌体生长及染料降解的影响  35-36
    2.3.6 盐度对菌体生长及染料降解的影响  36
    2.3.7 无外加碳源对菌体生长及染料降解的影响  36
    2.3.8 菌株Y3对不同偶氮染料的降解  36
    2.3.9 连续投加染料对降解率的影响  36
    2.3.10 染料浓度对降解率的影响  36
    2.3.11 染料及染料降解产物的紫外—可见光谱扫描  36
    2.3.12 染料及其降解产物的植物毒理测定  36-37
  2.4 结果与分析  37-45
    2.4.1 偶氮染料降解菌株的筛选结果  37
    2.4.2 形态及生理生化特性  37-38
    2.4.3 分子生物学鉴定  38-39
    2.4.4 细菌生长曲线及甲基红的降解曲线  39-40
    2.4.5 温度对菌体生长及染料降解的影响  40-41
    2.4.6 pH对菌体生长及染料降解的影响  41
    2.4.7 盐度对菌体生长及染料降解的影响  41-42
    2.4.8 无外加碳源对菌体生长及染料降解的影响  42
    2.4.9 菌株Y3对不同结构偶氮染料的降解  42-43
    2.4.10 连续投加染料对降解率的影响  43
    2.4.11 染料浓度对降解率的影响  43-44
    2.4.12 染料及染料降解产物的紫外—可见光谱扫描  44
    2.4.13 甲基红及其降解产物的植物毒理测试  44-45
  2.5 讨论  45-46
  2.6 本章小结  46-47
3 好氧偶氮染料降解菌的筛选及偶氮还原酶的纯化  47-67
  3.1 实验材料与仪器  47-48
    3.1.1 材料  47
    3.1.2 生化试剂  47
    3.1.3 实验仪器  47-48
  3.2 试剂配制  48
  3.3 实验方法  48-54
    3.3.1 好氧偶氮降解菌株的筛选  48-49
    3.3.2 菌株的鉴定  49
    3.3.3 温度对菌株CD-2生长及染料降解的影响  49
    3.3.4 pH值对菌株CD-2生长及染料降解的影响  49
    3.3.5 盐度对菌株CD-2生长及染料降解的影响  49
    3.3.6 菌株CD-2对不同偶氮染料的降解  49
    3.3.7 好氧偶氮染料降解过程中氧气的变化量  49
    3.3.8 偶氮还原酶粗酶液的制备  49-50
    3.3.9 酶活测定  50
    3.3.10 蛋白质含量的测定  50-51
    3.3.11 纯化步骤  51
    3.3.12 PAGE凝胶电泳  51-52
    3.3.13 蛋白质鉴定(基质辅助光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF)  52
    3.3.14 酶学性质测定  52-53
    3.3.15 偶氮还原酶米氏常数及最大反应速率的测定  53
    3.3.16 纯酶对甲基红降解能力的测定  53
    3.3.17 纯酶降解产物分析  53-54
  3.4 结果与分析  54-65
    3.4.1 好氧偶氮降解菌株的筛选与鉴定  54-55
    3.4.2 温度对菌株CD-2降解甲基红的影响  55
    3.4.3 pH值对菌株CD-2降解甲基红的影响  55-56
    3.4.4 盐度对菌株CD-2降解甲基红的影响  56
    3.4.5 菌株CD-2对不同偶氮染料的降解  56-57
    3.4.6 好氧降解过程中氧气变化量的测定  57
    3.4.7 偶氮还原酶的纯化结果  57
    3.4.8 PAGE凝胶电泳  57-59
    3.4.9 蛋白质鉴定结果  59
    3.4.10 pH值对酶活性及酶稳定性的影响  59-60
    3.4.11 温度对酶活性及酶稳定性的影响  60-61
    3.4.12 盐度对酶活性及酶稳定性的影响  61
    3.4.13 金属离子及抑制剂对偶氮还原酶酶活性的影响  61-62
    3.4.14 偶氮还原酶的K_m值和V_(max)的测定  62-63
    3.4.15 纯酶对甲基红的降解  63
    3.4.16 甲基红及其降解产物的高效液相色谱分析  63-65
  3.5 讨论  65-66
  3.6 本章小结  66-67
4 蒽醌介体对好氧偶氮还原的强化作用研究  67-76
  4.1 实验材料与仪器  67
    4.1.1 实验材料  67
    4.1.2 生化试剂  67
    4.1.3 实验仪器  67
  4.2 试剂及培养基配制  67-68
  4.3 实验方法  68-69
    4.3.1 细胞的破碎及细胞破碎液的制备  68
    4.3.2 酶活的测定  68
    4.3.3 蛋白质含量测定  68
    4.3.4 不同蒽醌介体对甲基橙好氧降解的影响  68
    4.3.5 介体浓度对甲基橙好氧降解的影响  68-69
    4.3.6 介体对不同偶氮染料好氧降解的影响  69
    4.3.7 介体对活性污泥好氧降解偶氮染料的影响  69
    4.3.8 介体对完整细胞或细胞提取物好氧降解偶氮染料的影响  69
  4.4 结果与分析  69-73
    4.4.1 不同蒽醌介体对菌株CD-2在好氧条件下降解甲基橙的影响  69-70
    4.4.2 不同浓度的2-羟基-1,4-萘醌对菌株CD-2在好氧条件下降解甲基橙的影响  70-71
    4.4.3 2-羟基-1,4-萘醌对菌株CD-2在好氧条件下降解不同偶氮染料的影响  71-72
    4.4.4 2-羟基-1,4-萘醌对活性污泥在好氧条件下降解甲基橙的影响  72-73
    4.4.5 蒽醌介体对细菌全细胞或细胞破碎液降解甲基红的影响  73
  4.5 讨论  73-74
  4.6 本章小结  74-76
5 利用PCR-DGGE技术对好氧及厌氧偶氮降解菌群的结构分析  76-91
  5.1 实验材料与仪器  76-77
    5.1.1 材料  76
    5.1.2 生化试剂  76
    5.1.3 实验仪器  76-77
  5.2 试剂配制  77-78
  5.3 实验方法  78-82
    5.3.1 好氧及厌氧混合菌群的培育  78-79
    5.3.2 混合菌群中偶氮染料降解菌株的分离  79
    5.3.3 分离菌株的鉴定  79
    5.3.4 混合菌群对偶氮染料降解效果的研究  79
    5.3.5 PCR-DGGE电泳  79-82
  5.4 结果与分析  82-89
    5.4.1 好氧及厌氧菌群中菌株的分离与鉴定  82
    5.4.2 混合菌群对偶氮染料降解效果的研究  82-84
    5.4.3 细菌菌群结构分析  84-89
  5.5 讨论  89-90
  5.6 本章小结  90-91
结论  91-93
参考文献  93-101
攻读学位期间发表的学术论文  101-102
致谢  102-103

偶氮染料脱色细菌的脱色特性及偶氮还原机理的研究

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