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污水中病毒浓集、消毒规律及灭活机理研究

作　者: 赵祖国
导　师: 李君文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 氯二氧化氯浓集脊髓灰质炎病毒消毒
分类号: X703
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

许多病毒性传染疾病都可以通过水或污水传播,严重威胁着人类的健康,污水中的病毒学安全已经引起广泛的关注。目前尚无十分有效的方法直接对污水中的较低浓度的病毒进行浓集和检测;对污水中病毒的消毒规律,尤其是病毒灭活机理的研究十分有限,而且结论不一,甚至相反。因此,本课题的目的是建立一种浓集污污水中病毒的有效方法;研究氯和二氧化氯灭活污水中微生物的规律,寻找用于评价污水消毒的指示微生物;并在核酸和蛋白质功能的水平阐明氯和二氧化氯灭活病毒的机理,以更好地指导污水消毒,确保污水的病毒学安全。首先在本实验室已有的载阳电荷滤材的基础上,以f2噬菌体和脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)作为指示病毒,通过采用向污水中投加聚氯化铝、并改变污水的温度和酸碱度等措施,使病毒浓集效果达到最优化。我们确定了病毒浓集的最佳条件:调节污水至pH6.5左右,向污水中加入聚氯化铝至30mg/L,在20-30℃的工作温度下,我们的方法可以使污水中的病毒回收率达到在80%以上,将我们的方法应用于大体积的城市污水中的病毒浓集,也取得了较好的效果。在不同的色度、浊度、温度、pH值、消毒剂浓度和氨氮值下进行消毒,结果发现,二氧化氯对污水的消毒效果优于氯;污水的色度、COD和浊度可降低氯和二氧化氯的效果;氨氮降低氯的消毒效果,但对二氧化氯的消毒效果无明显影响;提高温度有利于增强二者的消毒效果;pH值降低有利于氯的消毒;pH值升高有利于二氧化氯的消毒。消毒效果随着消毒剂浓度增加而增强;微生物对氯和二氧化氯的抵抗力强弱顺序为:PV>f2噬菌体>粪肠球菌>沙门氏菌>产气荚膜梭菌繁殖体>大肠杆菌,因此,我们建议将f2作为污水中的指示病毒、粪肠球菌作为指示细菌。以poliovirus type I sabin LS/2ab(PV1)作为研究对象,将不同剂量的氯(0.1、0.5、1.0、1.5和2.0mg/L)和二氧化氯(0.1、0.2、0.4、0.8和1.2mg/L)作用不同的时间(氯:0、10、15、25、30、40、45、55和60min,二氧化氯:0、1、2、4、8、和12min)进行组合,以尽可能获得刚好被灭活的PV1。用细胞培养、ELISA、PCR、核酸杂交、构建基因工程病毒和细胞培养-ELISA(combined cell culture-ELISA,CCC-ELISA)等方法来研究这两种消毒剂的消毒机理。首先,我们发现氯和二氧化氯都是通过破坏PV基因组非编码区(noncoding region,NCR)而灭活病毒,病毒最初的灭活与抗原性的破坏无关;氯优先破坏PV1的poly A尾和3’-NCR,随后是病毒的5’-NCR,二氧化氯则直接通过破坏5’-NCR而灭活病毒;两种消毒剂对PV1核酸不同的区域具的损伤有一定的选择性;研究结果表明,氯对PV1基因组的损伤主要位于60-80、234-274、300-317和483-501nt区域内,二氧化氯造成的损伤主要位于124-143、300-317、334-350和581-599nt区域内;氯对3’-NCR的损伤位于7405-7423区域内;我们成功地构建了基因组不同区域受损的多种PV1基因组模型,其中基因组5’-NCR受损的病毒基因组模型不具有感染性,而poly A尾和(或)3’-NCR受损的病毒则仍能感染性细胞;氯和二氧化氯灭活的、具有抗原性的PV1仍具有粘附并进入细胞的能力;氯灭活的PV衣壳仍具有脱衣壳的功能,但二氧化氯灭活的病毒却丧失了该功能。综上所述,我们得出了如下结论:1.建立并完善了污水中病毒的浓集方法,可以使大体积(20L)污水水样中的病毒回收率达到80%以上。2.二氧化氯对污水的消毒效果优于氯;氯和二氧化氯的消毒效果受多种水质条件的影响;建议用粪肠球菌作为指示细菌、f2噬菌体作为指示病毒来评价污水的消毒效果。3.氯和二氧化氯主要通过破坏病毒核酸灭活PV;对PV的致死性损伤都位于基因组的5’-NCR内,但二者在损伤基因组具体位点上存在差别。4.氯和二氧化氯可损伤PV1衣壳的而致其丧失侵入细胞的能力;与二氧化氯不同,氯灭活的病毒仍然具有脱衣壳的功能。

全文目录

缩略词表  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
绪论  11-20
  1 水和污水中的病毒的危害  11-13
  2 水和污水中病毒的消毒  13-14
  3 水和污水中病毒的浓集  14-15
  4 病毒灭活机理研究进展  15-16
  5 用于水和污水中病毒浓集和消毒的病毒  16-17
  6 课题研究思路  17-20
第一章污水中病毒浓集、回收方法的建立及应用  20-31
  1.1 材料与方法  20-25
    1.1.1 实验材料  20-22
    1.1.2 PV1 培养及浓缩  22
    1.1.3 病毒浓度测定  22-23
    1.1.4 载阳电荷粒状滤料的制备  23
    1.1.5 污水中病毒的浓集  23-24
    1.1.6 PAC对病毒浓集的影响  24
    1.1.7 pH值对病毒浓集的影响  24
    1.1.8 温度对病毒浓集的影响  24
    1.1.9 以优化的病毒浓集条件对污水中PV1 进行回收实验  24
    1.1.10 病毒浓集方法对大体积污水水样的病毒回收实验  24-25
    1.1.11 统计方法  25
  1.2 实验结果  25-28
    1.2.1 不同浓度PAC对f2 噬菌体回收的影响因素  25
    1.2.2 pH值的对f2 噬菌体回收的影响  25-27
    1.2.3 温度对f2 噬菌体回收的影响  27
    1.2.4 PAC对大体积污水中的病毒的浓集作用  27
    1.2.5 病毒浓集方法的实际应用  27-28
  1.3 讨论  28-30
  1.4 小结  30-31
第二章氯和二氧化氯消毒规律  31-43
  2.1 材料与方法  31-34
    2.1.1 实验材料  31-32
    2.1.2 细菌计数  32
    2.1.3 f_2 噬菌体增殖和计数  32-33
    2.1.4 病毒 PV1 增殖与计数  33
    2.1.5 氯、二氧化氯的制备及浓度测定  33
    2.1.6 无氯耗的水及容器的制备  33
    2.1.7 微生物污染水样的制备  33-34
    2.1.8 消毒方法及效果分析  34
    2.1.9 不同实验条件下氯和二氧化氯的消毒效果评价  34
    2.1.10 统计方法  34
  2.2 结果  34-40
    2.2.1 微生物对氯和二氧化氯消毒抵抗力的比较  34-35
    2.2.2 消毒的影响因素  35-40
      2.2.2.1 氯和二氧化氯作用时间对消毒消毒效果的影响  35
      2.2.2.2 温度对氯和二氧化氯消毒的影响  35
      2.2.2.3 COD值对氯和二氧化氯消毒的影响  35-36
      2.2.2.4 NH_4~+-N含量对氯和二氧化氯消毒的影响  36
      2.2.2.5 色度对氯和二氧化氯消毒的影响  36
      2.2.2.6 pH值对氯和二氧化氯消毒的影响  36
      2.2.2.7 浊度对二氧化氯和二氧化氯消毒的影响  36-40
  2.3 讨论  40-42
  2.4 小结  42-43
第三章氯和二氧化氯破坏PV1 核酸和衣壳在病毒灭活中的作用  43-60
  3.1 材料与方法  44-49
    3.1.1 实验材料  44-46
    3.1.2 氯和二氧化氯的制备及定量  46
    3.1.3 无氯耗的容器及水的制备  46
    3.1.4 病毒悬液制备  46
    3.1.5 消毒实验  46
    3.1.6 PV1 核酸的提取  46-47
    3.1.7 Long-overlapping PCR分析PV1 基因组的损伤  47-48
    3.1.8 PV1 抗原的测定  48-49
    3.1.9 灭火效果的分析  49
    3.1.10 统计方法  49
  3.2 实验结果  49-56
    3.2.1 氯和二氧化氯对抗原性和感染性的影响  49-51
    3.2.2 氯和二氧化氯对PV1 基因组损伤区域的初步分析  51-53
    3.2.3 氯和二氧化氯对PV1 5’端和3’端损伤的分析  53-56
  3.3 讨论  56-58
  3.4 小结  58-60
第四章 PV1 基因组受氯和二氧化氯损伤位点的定位和相应位点缺失的病毒基因组模型构建及其感染性分析  60-77
  4.1 材料与方法  60-68
    4.1.1 材料与试剂  60-62
    4.1.2 病毒RNA的提取  62
    4.1.3 Northern Blotting 定位病毒基因组受损位点  62-64
      4.1.3.1 DNA探针的设计  62
      4.1.3.2 RNA固定于尼龙膜  62
      4.1.3.3 探针与PV1 基因组杂交  62-63
      4.1.3.4 核酸杂交敏感性分析  63-64
    4.1.4 敲除氯和二氧化氯损伤位点的病毒基因组模型的构建  64-68
      4.1.4.1 病毒基因组的分段PCR扩增  64-66
      4.1.4.2 PV1 DNA 片段的连接  66
      4.1.4.3 合成PV1 基因组RNA  66-67
      4.1.4.4 PV1 基因组模型 RNA感染性的测定  67-68
  4.2 结果  68-74
    4.2.1 病毒基因组受损区域定位  68-71
    4.2.2 基因组受损病毒基因组模型的构建及其感染性分析  71-74
      4.2.2.1 基因组受损病毒基因组模型的构建  71-73
      4.2.2.2 基因组受损病毒基因组模型的感染性分析  73-74
  4.3 讨论  74-76
  4.4 小结  76-77
第五章氯和二氧化氯对PV1 衣壳蛋白功能的影响  77-86
  5.1 材料与方法  78-80
    5.1.1 材料与试剂  78
    5.1.2 病毒消毒实验  78
    5.1.3 病毒粘附细胞能力检测  78-79
    5.1.4 病毒进入能力的检测  79
    5.1.5 病毒脱衣壳能力的检测  79-80
    5.1.6 统计方法  80
  5.2 实验结果  80-84
    5.2.1 病毒粘附细胞能力的检测  80-83
    5.2.2 病毒进入细胞能力的检测  83
    5.2.3 病毒脱衣壳能力的检测  83-84
  5.3 讨论  84-85
  5.4 小结  85-86
结论  86-88
参考文献  88-95
个人简历  95-96
致谢  96

污水中病毒浓集、消毒规律及灭活机理研究

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