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硫化氢后处理激活线粒体ATP敏感性钾通道和PI3K/Akt保护缺血大鼠心肌

作　者: 季永
导　师: 曾因明
学　校: 中国医科大学
专　业: 麻醉学
关键词: 硫化氢后处理缺血再灌注线粒体通透性转换孔线粒体ATP敏感性钾通道 Akt 磷脂酰肌醇3激酶
分类号: R541
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目的硫化氢是一种内源性气体信号分子,可以在半胱氨酸代谢过程中通过心血管系统胱硫醚-γ-裂解酶的作用下内源性合成。研究表明硫化氢预处理对缺血再灌注心肌有确切的保护作用。硫化氢后处理对缺血再灌注心肌是否有保护作用,以及其保护作用的内源性机制有待于研究。本实验用大鼠离体心脏Langendorff缺血再灌注模型和培养心肌细胞缺氧复氧模型,从器官、细胞、线粒体、分子水平研究硫化氢后处理对缺血再灌注心肌的作用。本实验的目的:(1)探讨再灌注早期给予硫化氢处理是否能减轻心肌缺血再灌注损伤;(2)探讨硫化氢后处理心肌保护作用机制是否与线粒体ATP敏感性钾通道开放有关;(3)研究PI3K/Akt/GSK3β信号通路是否参与了硫化氢和处理的心肌保护作用机制;(4)探讨硫化氢后处理诱导线粒体ATP敏感性钾通道开放和PI3K/Akt/GSK3β激活对线粒体通透性转换(MPT)是否有调节作用。方法1、再灌注早期硫化氢后处理保护心肌免受再灌注损伤所有离体灌注的大鼠心脏经受30分钟缺血和90分钟再灌注。后处理方式:再灌注即刻给予4次15秒缺血或含硫氢化钠的灌注液处理间隔15秒含氧灌注液灌注。48只大鼠随机分入以下6组,每组8只:缺血/再灌注(CON)、缺血后处理组(Pcon);0.1μmol/L硫氢化钠后处理组(NP0.1);1μmol/L硫氢化钠后处理组(NP1);10μmol/L硫氢化钠后处理组(NP10);100μmol/L硫氢化钠后处理组(NP100)。观察各组血流动力学指标、冠脉漏出液肌酸激酶、乳酸脱氢酶释放和心肌梗死面积变化。2、硫化氢后处理中线粒体ATP敏感性钾通道的作用灌注方案同实验一。大鼠随机分为7组,每组8只:0.2%dimethyl sulfoxide(DMSO)溶剂对照组(Vehicle);缺血再灌注对照组(CON);1μmol/L硫化氢后处理组(NP1);100μmol/L 5-羟葵酸拮抗NP1组(5-HD+NP1);10μmol/L格列本脲拮抗NP1组(Gli+NP1);100μmol/L 5-羟葵酸组(5-HD);10μmol/L格列本脲组(Gli)。观察各组血流动力学指标、冠脉漏出液肌酸激酶、乳酸脱氢酶释放和心肌梗死面积变化。3、硫化氢后处理中PI3K-Akt-GSK3β信号通路的作用缺血再灌注方案同实验一。大鼠随机分入以下5组,每组8只:0.2%DMSO溶剂对照组(Vehicle);缺血再灌注对照组(CON);1μmol/L硫化氢后处理组(NP1)、15μmol/L的LY294002拮抗NPl组(LY+NPl);15μmol/L的LY294002溶于0.02%DMSO组(LY)。观察各组心脏心功能、酶学、心肌梗死面积指标,免疫组化和Western blot检测磷酸化Akt和磷酸化GSK3β的表达。4、硫化氢后处理中线粒体通透性转换孔道的作用乳鼠心肌细胞培养后经受2小时缺氧2小时复氧复制缺氧/复氧模型。同批培养的心肌细胞随机分入以下6组:(CON)缺氧/复氧组;(NP1)1μmol/L硫氢化钠后处理组;(NP1+5-HD)1μmol/L硫氢化钠后处理+100μmol/L的5羟葵酸组;(NP1+LY)1μmol/L硫氢化钠后处理+15μmol/L的LY294002组;(LY)15μmol/L的LY294002组;(5-HD)100μmol/L的5-HD组。检测各组细胞存活率、线粒体游离钙、线粒体活性氧、线粒体膜电位、线粒体通透性转换、线粒体胞浆细胞色素C含量和线粒体电镜分析。5、统计学分析所有计量资料数据用((?)±s)表示。SPSS13.0统计学软件分析数据,组间比较用单因素方差分析,SNK检验。P＜0.05认为有统计学意义。结果1、硫化氢后处理保护大鼠心肌免受再灌注损伤再灌注60和90分钟,Pcon(69±5,66±7mmHg),NP0.1(65±6,63±5mmHg),NP1(67±6,65±7mmHg),NP10(61±5,60±6mmHg)各组的LVDP分别显著高于缺血再灌注CON组(48±8,43±6mmHg)(均P＜0.05);Pcon心肌梗塞面积(21.7±6.2%)低于CON(47.6±5.3%,P＜0.05)。与CON比较,0.1-10μmol/L硫氢化钠后处理各组剂量依赖性减少心肌梗塞面积(NP0.1,34.2±5.1%,NP1,23.4±4.6%,NP10,25.1±7.2%,P＜0.05与CON组比较),而100μmol/L NaHS未能减少梗死面积。与CON比较,Pcon明显抑制了冠脉漏出液中CK、LDH的释放(均P＜0.05);NP0.1、NP1、NPl0也剂量依赖性抑制了CK、LDH的释放(均P＜0.05)。2、硫化氢后处理开放ATP敏感性钾通道保护心肌根据实验一量效关系结果,选择1μmol/L的NaHS为后处理代表性硫化氢后处理剂量,进一步研究钾通道阻断剂是否能拮抗硫氢化钠的心肌保护作用。结果显示,10μmol/L格列苯脲和100μmol/L的5-HD均拮抗了NP1组减少心肌梗塞面积的保护作用(Gli+NP1,46.5±8.6%;5-HD+NP1,42.0±10.3%,P＜0.05与NP1组比较,23.4±4.6%)。再灌注早期给与10μmol/L格列苯脲或100μmol/L 5-HD均能拮抗硫化氢后处理再灌注60、90分钟提高LVDP的作用(均P＜0.05)。同时,还拮抗了NP1组抑制CK、LDH释放的保护作用(均P＜0.05)。3、硫化氢后处理激活PI3K-Atk-GSK3β信号通路保护心肌与CON组比较,NP1组心肌梗塞面积(23.4±7.2%)明显小于CON(47.6±5.3%,P＜0.05);NP1明显抑制冠脉漏出液CK,LDH的释放(均P＜0.05)。NP1组显著提高了磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3p(Ser9)的表达(均P＜0.05)。15μmol/L的LY294002拮抗了硫化氢后处理减少心肌梗塞面积的作用,LY+NP1组(44.5±6.7%)梗死面积高于NP1组(23.4±7.2%,P＜0.05)。LY294002拮抗了NP1组限制心肌CK、LDH释放的保护作用(均P＜0.05)。同时LY+NP1组的磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3p(Ser9)的表达显著低于NP1组(均P＜0.05)。4、硫化氢后处理激活ATP敏感性钾通道和PI3K-Ark-GSK-3β信号最终抑制线粒体通透性转换缺氧复氧末NP1组心肌细胞存活率高于CON(49.1±3.8%vs 31.9±4.1%,P＜0.05);线粒体游离钙浓度低于CON(424.3±14.7 vs 712.8±18.4 nmol/mg.pro,P＜0.05);线粒体活性氧产生速率低于CON(8.1±0.6 vs 13.2±0.7 fluorescenceunits/sec.mg.pro,P＜0.05);线粒体膜电位TMRE荧光相对值高于CON(73.6±4.5%vs51.6±6.1%,P＜0.05);Calcein荧光相对值高CON(提示抑制了线粒体通透性转换)(61.7±7.5%vs 39.4±5.2%,P＜0.05),增加了线粒体细胞色素C的含量保存(P＜0.05),减少了胞浆细胞色素C的释放(P＜0.05),保存了线粒体超微结构完整。100μmol/L的5-HD完全拮抗了NP1组以上保护效果(均P＜0.05)。15μmol/L的LY294002拮抗了NP1组在细胞存活率以及线粒体膜电位、MPTP方面、细胞色素C释放的保护作用(均P＜0.05),而未能拮抗NP1组对线粒体钙、活性氧的抑制作用。结论(1)硫化氢后处理能够保护缺血再灌注大鼠心脏免受再灌注损伤。其保护作用体现在:抑制线粒体游离钙超载和线粒体活性氧的产生,抑制线粒体通透性转换的发生,提高复氧心肌细胞膜电位,保护线粒体超微结构的完整,减少线粒体细胞色素C的释放。最终提高复氧细胞存活率,减少心肌梗塞面积,提高再灌注心肌收缩功能。(2)硫化氢后处理心肌保护机制包括线粒体ATP敏感性钾通道的开放。(3)硫化氢后处理激活线粒体ATP敏感性钾通道开放,抑制线粒体钙超载和活性氧产生,从而继发性抑制了线粒体通透性转换的发生。(4)硫化氢后处理心肌保护机制还包括激活PI3K-Atk-GSK3β信号通路,磷酸化GSK3β(ser9)抑制线粒体通透性转换的发生。

全文目录

一、摘要  6-16
  中文摘要  6-10
  英文摘要  10-16
二、英文缩略语  16-17
三、论文  17-92
  论文一缺血和硫化氢后处理对离体灌注大鼠心脏的保护  17-34
    前言  17-18
    材料与方法  18-24
    实验结果  24-28
    讨论  28-33
    结论  33-34
  论文二 ATP敏感性钾通道在硫化氢后处理中的作用  34-44
    前言  34
    材料与方法  34-36
    实验结果  36-39
    讨论  39-43
    结论  43-44
  论文三 PI3K-Akt信号通路在硫化氢后处理中的作用  44-65
    前言  44-45
    材料与方法  45-49
    实验结果  49-61
    讨论  61-64
    结论  64-65
  论文四硫化氢后处理心肌保护的线粒体机制  65-92
    前言  65
    材料与方法  65-72
    实验结果  72-89
    讨论  89-90
    结论  90-92
四、本研究创新性的自我评价  92-93
五、参考文献  93-100
六、附录  100-114
  综述  100-112
  在学期间科研成绩  112-113
  致谢  113-114
  个人简介  114

硫化氢后处理激活线粒体ATP敏感性钾通道和PI3K/Akt保护缺血大鼠心肌

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