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变铅青链霉菌中DNA硫化修饰基因组岛的分子遗传学研究

作　者: 贺新义
导　师: 邓子新
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物学
关键词: 变铅青链霉菌 基因组岛 DNA硫化修饰 限制系统
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


本研究在比较野生型变铅青链霉菌和ZX1的染色体稀有限制性片段时,完善了它的染色体物理图谱,发现一个长约90kb的AseI片段在ZX1染色体上发生了缺失,它位于AseI-Aa(1800 kb)和AseI-Ab(900 kb)之间,当90kb序列发生缺失时,ZX1染色体上形成了一个2700 kb的AseI-A片段。通过对包含缺失界点,缺失融合点克隆序列的详细分析发现:在野生型变铅青链霉菌上,这个90 kb DNA大片段两端各有一个15 bp的正向重复序列,而在突变株ZX1里,90kb DNA序列发生了精确的环出,正好由这两个正向重复序列介导,融合点处保留了一个15 bp的序列。对包含整个90 kb序列的3个科斯质粒进行了测序揭示了一个包含DNA硫修饰系统的典型基因组岛简称为SLG,其序列共计92,770 bp。其总体G+C百分含量是67.8%,比已经测序的三个链霉菌的基因组要低。在85个预测的开放阅读框中,22个和现有数据库中的编码蛋白没有序列同源性。通过对它4个模块的G+C百分含量,二核苷酸偏向性,以及编码蛋白的同源性分析,证明它具有典型的外来因子的特征。在实验室条件下,我们检测到SLG可以自发的切除和环化,利用实时定量PCR我们精确确定了基因岛切除的频率,它们在几种不同的培养基条件下,环出频率相近,约为0.016%到0.027%之间。这种切除的频率可以被NTG处理上调5倍以上。通过构建系列的基因组小岛,我们证明了一个类似P4噬菌体的整合酶可以介导SLG的切除,环化和整合。到目前为止,另外12个硫修饰基因簇也都被定位到其它的基因组岛或者质粒上,包含这些基因组岛的细菌在分类和地理位置上差别很大。另外,为了确定dnd在放线菌中的分布,对我室74株收藏的放线菌菌株约有10%含有这种修饰系统。新鉴定出来含有dnd基因簇的放线菌都没有类似SLG中发现的整合酶。对这12个DNA硫修饰系统的上下游基因的比较发现:这些含硫修饰系统有可能来自于一个共同的祖先,它类似于Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125中起源于质粒的第二条染色体。我们考察了SLG的可移动性,通过在SLG基因组岛内部不同位置上进行的标记,来尝试不同条件下的孢子杂交和接合转移,试图再现SLG在实验室条件下的平行转移。但是均未能成功,在进化的过程中, SLG可能已经丧失了在不同种或同种之间转移的能力,这一点和这个基因组岛马赛克结构和没有编码完整接合转移功能蛋白是吻合的。最后我们在近缘天蓝色链霉菌中发现了一种DNA硫化修饰依赖型的强限制系统。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第一章：文献终述  12-38
  1.1 细菌中的基因组岛  12-28
  1.2 链霉菌简介  28-34
  1.3 DNA 磷硫化修饰的进展  34-36
  1.4 对于基因组到研究的结论和今后的挑战  36-38
第二章 实验材料和方法  38-51
  2.1 实验材料  38-43
  2.2 大肠杆菌和链霉菌质粒DNA 快速提取及检测  43-44
  2.3 链霉菌总DNA 的少量快速提取  44
  2.4 高压电穿孔法转化大肠杆菌(参考EquiBio公司说明书,见下文)  44-45
  2.5 DNA 测序及序列分析  45-46
  2.6 PCR 引物和PCR 的条件  46
  2.7 荧光实时定量  46-47
  2.8 通过pJTU1514 上携带的基因小岛的环出来确定整合酶活性  47
  2.9 两亲本杂交介导的质粒DNA 的跨属转移  47
  2.10 链霉菌之间的孢子杂交  47-48
  2.11 脉冲电泳(PFGE) 分离大片段DNA  48-49
  2.12 DNA-DNA 放射性杂交  49-51
第三章 突变株ZX1 染色体上缺失端点及界点的序列分析  51-56
  3.1 变铅青链霉菌突变株ZX1 缺失端点和融合界点的克隆  51-53
  3.2 变铅青链霉菌突变株ZX1 缺失端点和融合界点的序列分析  53-54
  3.3 天蓝色链霉菌M145 以及对应的变铅青链霉菌ZX1 融合点处的序列分析  54-56
第四章 90 kb 含硫修饰基因组岛在染色体上的定位以及野生型变铅青链霉菌1326 染色体物理图谱的完善  56-64
  4.1 前期工作简介  56
  4.2 野生型变铅青链霉菌66 和突变株ZX1 的染色体AseI 片段图谱的比较  56-59
  4.3 Southern 杂交确定ZX1 包含dnd 基因簇的片段在染色体上的位置  59-64
第五章 SLG 全序列的测定  64-76
  5.1 前期工作简介  64-65
  5.2 测序文库粘粒的选取及序列分析  65-68
  5.3 基因组岛的序列详细分析  68-76
第六章 SLG 的自发切除和环化的检测  76-80
  6.1 SLG 的自发切除和环化  76-80
第七章 SLG 切除环化和整合过程必需的功能基因的定位  80-86
  7.1 人工构建基因小岛模拟基因组岛环出和整合全过程  80-81
  7.2 SLG 切除环化和整合必须功能基因的定位  81-86
第八章 DNA 磷硫酰修饰基因簇在细菌中广泛性  86-93
  8.1 dnd 基因簇在不同类型的细菌中广泛存在  86-89
  8.2 dnd 基因簇在同一种属的细菌中的分布  89-92
  8.3 细菌基因组的dnd 基因簇都位于可移动的因子上  92-93
第九章 考察SLG 在链霉菌中可移动性  93-95
  9.1 SLG 在链霉菌中的种间和种内的接合转移的尝试  93-95
第十章 dnd 基因簇编码功能特异性强限制性系统的发现  95-106
  10.1 DNA 修饰-限制系统简介  95-97
  10.2 整合型dnd 基因簇在天蓝色链霉菌M145 中的异常表达  97-98
  10.3 dnd 不表达的原因研究  98-102
  10.4 天蓝色链霉菌中 DNA 硫化修饰依赖性的强限制系统的发现  102-105
  本章小结  105-106
第十一章 总结与展望  106-113
  11.1 本研究工作总结及主要创新点  106-109
  11.2 讨论与展望  109-111
  11.3 进一步相关工作的  111-113
参考文献  113-129
附表  129-135
致谢  135-137
攻读学位期间发表的学术论文  137-138
攻读学位期间发表的学术论文  138

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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