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胶原杂化去抗原松质骨复合间充质干细胞修复骨软骨缺损的实验研究

作　者: 孙效棠
导　师: 胡蕴玉；赵黎
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 骨软骨去抗原松质骨间充质干细胞胶原
分类号: R687
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

实验一关节腔和骨髓腔环境对纤维期骨痂分化发育的影响目的:探讨纤维期骨痂在关节腔环境和骨髓腔环境分化发育的差别。方法:成年普通家兔10只,通过穿刺获取胫骨上段松质骨中骨髓和膝关节关节液,立即在血气分析仪上测出PH值及氧分压,同一只动物的上述数据进行配对t检验,判断关节液和骨髓在上述指标上的差别;制备兔桡骨骨折模型,将术后12 d的骨折处纤维骨痂切取一部分,分为两段,一段作组织学观察,另一段移植到自体的膝关节腔中,3 w后观察骨折局部和关节腔中的纤维骨痂分化发育的结果。结果:兔的关节液和骨髓在PH值和氧分压上有明显的差别,关节液PH值为6.213±0.097,骨髓PH值为7.223±0.0677,两者差别有统计学意义（P<0.05）;关节液氧分压7.62±0.466mmHg,骨髓氧分压为50.50±2.470mmHg,两者差别有统计学意义（P<0.05）。兔桡骨骨折模型在骨折后12 d时形成的是成分较单一的纤维骨痂,15只动物中有11只此期的骨痂移植到关节腔3 w后呈现典型的软骨形态,还可观察到前体细胞到向软骨细胞分化的过渡状态,其余4只动物植入的纤维骨痂没有找到,原骨折处骨痂已经发生明显的骨化。结论:关节腔和骨髓腔是两种不同的体内微环境,同一种前体细胞在这两种环境当中会分别向成骨和成软骨方向分化。实验二两种去抗原处理方法对松质骨微观结构的影响目的:观察对松质骨载体进行去抗原处理脱脂、脱蛋白和脱钙的过程中使用不同的方案对松质骨微观结构的影响。方法:获取新鲜的小牛干骺端松质骨,锯成体积约15mm×10mm×10mm的骨块。用两种方案进行后续的处理（每种方案各处理5块样品）。方案一:甲醇:氯仿=1:1（ml:ml）脱脂24h→30%H₂O₂脱蛋白24h→0.6HCLmol/L盐酸脱钙6min;方案二:甲醇:氯仿=1:1（ml:ml）脱脂24h→2mol/LCaCl₂脱蛋白24h→8mol/L LiCl脱蛋白24h→10%H2O2脱蛋白12h→0.5mol/L EDTA四钠脱钙15 d。上述两种方案处理的标本经过固定、脱水、包埋、切片后透射电镜观察骨基质当中胶原纤维的形态。结果:用上述两种方案处理的松质骨标本在大体外观上没有明显的差别,都呈白色半透明状,有弹性,吸水性良好。透射电镜可以观察到用方案一处理过的松质骨载体基质呈均质状形态,没有明显的胶原纤维束存在;用方案二处理过的松质骨载体基质当中仍可见排列较规则的胶原纤维束。结论:松质骨两种去抗原的方案虽然在产物的大体外观性状上没有明显的差别,但是方案二对松质骨基质的微观结构保存得较好。实验三去抗原松质骨载体生物相容性及复合软骨细胞后成软骨性能的观察目的:观察去抗原松质骨载体的生物相容性及其复合软骨细胞后在裸鼠皮下成软骨的能力。方法:同实验二用方案二制备去抗原松质骨载体,照射消毒备用。通过穿刺得到兔骨髓,洗涤、接种、培养扩增后获得间充质干细胞,以1×10⁵/ml的浓度接种到去抗原松质骨中;获取兔膝关节软骨,冲洗、剪碎、消化、接种、培养扩增后,以1×10⁵/ml的浓度接种到去抗原松质骨上,用倒置显微镜、扫描电镜观察间充质干细胞和软骨细胞在去抗原松质骨表面的生长情况;采用同样方法将软骨细胞以1×10⁶/ml接种到去抗原松质骨上,体外培养一周后埋植于裸鼠背部皮下,6 w后观察组织形成的情况。结果:细胞悬液很容易被去抗原松质骨载体吸收,间充质干细胞和软骨细胞均能够紧密围绕载体生长,并且能够在载体表面粘附、铺展、分泌基质。去抗原松质骨载体负载软骨细胞在裸鼠皮下并不能生成大块的软骨组织,但是沿松质骨骨小梁表面可见有明显的软骨细胞生长。结论:去抗原松质骨载体有良好吸水性和生物相容性,但是由于其孔隙太大,因此负载的软骨细胞很难将这些孔隙填满,植入体内以后易被纤维组织所占据。实验四鼠尾胶原杂化去抗原松质骨载体的制备及生物相容性的观察目的:制备鼠尾胶原并用鼠尾胶原杂化去抗原松质骨使得软骨细胞在载体孔隙中均匀分布,最终能够形成组织结构良好的软骨组织。方法:通过酸解-酶解的方法制备鼠尾胶原,用SPS-PAGE测定分子量,紫外分光光度法测定其吸收峰及微量凯氏定氮法测定氮含量来对胶原产物进行定性和定量分析。用50%胶原醋酸溶液杂化去抗原松质骨载体后,按照实验二和实验三的方法获取骨髓间充质干细胞和软骨细胞,分别将两种细胞以1×10⁵/ml的浓度接种到胶原杂化去抗原松质骨载体中,体外培养1 w后用扫描电镜观察细胞在载体上的生长情况。用1×10⁶/ml浓度的软骨细胞悬液接种胶原杂化去抗原松质骨载体,体外培养1 w后埋植到裸鼠皮下,6 w以后观察组织生成的情况。结果:通过酸解-酶解的方法制备鼠尾胶原过程较为简单,产物具备I型胶原的特征:分子量约为97KD,在230nm处有最高的紫外光吸收峰。微量凯氏定氮法测得胶原浓度为4.0mg/ml,纯度为96%。胶原杂化去抗原松质骨载体在大孔中由胶原形成了许多密集的小孔,图像分析提示松质骨载体大孔的直径为400-1000um,在这些大孔中由胶原束构成的小孔的直径为50-80um。软骨细胞和间充质干细胞在此载体上能够良好地附着、扩增并分泌基质。负载软骨细胞后在裸鼠皮下能够形成结构良好的软骨组织。结论:鼠尾胶原为纯度很高的I型胶原,具有良好的生物相容性,软骨细胞在胶原杂化去抗原松质骨载体中能够均匀分布并且能够形成结构良好的软骨组织。实验五胶原杂化去抗原松质骨载体复合间充质干细胞修复兔骨软骨缺损目的:制备胶原杂化的去抗原松质骨载体并复合自体间充质干细胞修复关节的骨软骨缺损。方法:通过实验四的方法制备胶原杂化去抗原松质骨载体。通过骨穿获取自体骨髓,体外培养、扩增获取间充质干细胞,然后接种到胶原杂化的松质骨载体上,体外继续培养一周后植入到动物的左膝关节（实验侧）,作为自体对照,右膝关节植入没有复合细胞的胶原杂化去抗原松质骨载体上,在第6、12、24、48周时取材观察实验侧和对照侧的骨软骨缺损的组织修复情况,并进行Pineda评分和统计学分析比较实验侧和对照侧的差异。结果: 6周时实验侧骨软骨缺损内充填以纤维样新生组织,没有明确的软骨和骨形成;对照侧骨软骨缺损内同样有纤维样组织,但是细胞数量较实验侧稀少。12周时实验侧骨软骨缺损内部分充填以软骨样组织,软骨下骨有部分骨小梁充填;对照侧骨软骨缺损内均还是以部分纤维样组织充填,没有骨软骨形成。24周时实验侧骨软骨缺损内充填以软骨样组织,软骨下骨及潮线基本恢复;对照侧软骨缺损内以纤维样组织充填,周围软骨组织有向缺损部分增殖,软骨下骨及潮线恢复不明显。48周时实验侧骨软骨缺损内充填以软骨样组织,但是厚度变薄,软骨下骨及潮线基本恢复;对照侧软骨缺损内以少量纤维样组织充填。上述各时间点实验侧和对照侧的Pineda评分均有统计学差别（P<0.05）,但是以第12、24和48周明显。结论:胶原杂化的去抗原松质骨载体复合间充质干细胞能够以一体化的方式修复关节的骨软骨缺损。

全文目录

缩略语表  4-6
中文摘要  6-11
英文摘要  11-18
前言和文献回顾  18-39
正文  39-70
  1 实验一关节腔和骨髓腔环境对纤维期骨痂分化发育的影响  39-45
    1. 材料与方法  39-41
    2. 结果  41-42
    3. 讨论  42-45
  2 实验二两种去抗原处理方法对松质骨微观结构的影响  45-49
    1. 材料和方法  45-47
    2.结果  47
    3.讨论  47-49
  3 实验三去抗原松质骨载体生物相容性及复合软骨细胞后成软骨性能的观察  49-54
    1. 材料与方法  49-52
    2. 结果  52-53
    3 . 讨论  53-54
  4 实验四鼠尾胶原杂化去抗原松质骨载体的制备及生物相容性的观察  54-60
    1.材料与方法  55-58
    2.结果  58
    3.讨论  58-60
  5 实验五胶原杂化去抗原松质骨载体复合间充质干细胞修复兔骨软骨缺损  60-70
    1. 材料和方法  61-63
    2.结果  63-66
    3.讨论  66-70
小结  70-71
参考文献  71-92
附录  92-105
个人简历  105-107
致谢  107

胶原杂化去抗原松质骨复合间充质干细胞修复骨软骨缺损的实验研究

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