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外界环境与不同方药对CIA大鼠证候及T细胞亚型漂移影响的比较研究

作　者: 周刚
导　师: 王庆国
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中医临床基础
关键词: 类风湿性关节炎痹证外界环境宣痹汤桂枝芍药知母汤方证相应 Th1/Th2漂移
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因不明的慢性、进展性、自身免疫性疾病。其病理特征为单核细胞浸润、滑膜细胞增生、血管翳形成，以及软骨侵蚀和关节破坏。临床表现为关节对称性疼痛、运动障碍、甚至关节强直畸形致残，以及多脏器受累。目前RA的具体发病机制尚不清楚，多数学者认为，RA是由遗传与环境因素共同作用而引起的一种自身免疫性疾病。RA在中医学属痹证范畴。“痹”字最早见于《黄帝内经》，其病因据“风寒湿三气杂至”及“邪之所凑，其气必虚”的理论，为“内外合邪”所致。张仲景秉承《内经》之旨，开痹证辨证论治之先河，后世医家多遵从《内经》及《金匮要略》之论痹，结合各自所处历史环境与个人临床经验，从不同角度深入对痹证病因病机的认识，并立法组方遣药，或配以针灸、导引等外治法，使痹证证治丰富多彩，各具特色。而治痹方药之组成、配伍，以及方药之寒热温凉等属性，只有与痹证之“证候要素”、“病机”高度相符，该方药才能获得最佳疗效。这即是痹证“方证相应”理论的研究内容，也是痹证临床辨治的客观要求。为观察外界环境对痹证证候的影响，验证痹证乃“内外合邪”的病因学理论，并研究治痹方药与痹证证型的相关性及该相关性的生物学内涵，本课题以RA目前最为公认的动物模型，即Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型作为热痹证大鼠模型，采用“人工气候”试验箱进行外界环境的“风寒湿”或“风湿热”干预，再选用治疗热痹证的代表方剂——宣痹汤以及治疗寒热错杂痹证的代表方剂——桂枝芍药知母汤进行交叉治疗干预，进行了有关痹证病因学理论以及痹证“方证相应”理论的动物实验研究。1．实验用Ⅱ型胶原在Wistar大鼠诱导CIA模型。在二次免疫后，即从第2周开始，M(模型)组大鼠非致炎足(左足)出现炎性改变，其临床体征与人RA体征相似，血清Anti-CII、IgG抗体以及INF-γ、IL-4、TNF-a等细胞因子显著升高，踝关节H-E染色观察发现典型的RA炎症性改变。综合体征及微观生物学指标，可认为CIA造模成功，热痹证模型建立。2．在CIA造模成功的基础上，采用“人工气候”试验箱，对模型大鼠“风寒湿”(C组)或“风湿热”(H组)干预三周，定量分析大鼠舌象，并观察宏观体征。结果显示，C组大鼠可辨为寒痹证；H组大鼠仍可辨为热痹证，但兼夹瘀血因素。与M组比较，C组IgG抗体、INF-γ、IL-4、TNF-a水平均显著下降，Anti-CII抗体亦下降，H组IgG抗体、INF-γ、IL-4水平显著下降，TNF-a水平亦下降，Anti-CII抗体水平未见明显改变；流式细胞术结果显示，C组Th1、Th1／Th2均显著降低，H组仅见Th1／Th2下降，Th1、Th2所占淋巴细胞比率无明显变化；荧光实时定量(Real-time)PCR技术测定显示，C组T-bet mRNA表达下调，IL-4 mRNA表达显著上调，C组和H组INF-γmRNA表达均下调，差异均具有显著性，但T-bet／GATA-3比值两组均无统计学改变；关节H-E染色后观察显示，H组与M组相似，均病变重，C组病变较轻，偶见炎症细胞浸润。综合宏观体征和微观指标分析表明，“风寒湿”和“风湿热”均能改善Th1／Th2漂移，其中“风寒湿”改善更为明显，但二者对T-bet／GATA-3比值均无明显影响。3．采用同样的实验技术，对M组CIA大鼠灌胃给予宣痹汤(X组)及桂枝芍药知母汤(G组)三周后显示，两组大鼠血清IgG抗体、INF-γ、IL-4、TNF-a水平均降低，Th1、Th1／Th2均显著降低，Th2显著上升，T-bet、INF-γmRNA表达显著下调，IL-4 mRNA表达显著上调，T-bet／GATA-3在G组有改变，在X组明显改变。H-E染色显示，G组病变仍较重，X组偶见炎症细胞，病变减轻。此外，使用缺口末端标记法(TUNEL)原位检测关节组织细胞凋亡显示，两组细胞凋亡率均明显下降，但X组更明显。综合宏观体征和微观指标，宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比，前者能更好地治疗CIA大鼠，逆转Th1／Th2漂移，下调T-bet／GATA-3比值。4．同样，对“风寒湿”干预三周后的CIA大鼠，灌胃给予宣痹汤(C+X组)及桂枝芍药知母汤(C+G组)干预三周，结果显示，C+X组大鼠血清Anti-CII抗体水平显著上升，Th1，Th1／Th2亦显著上升，C+G和C+X组均见IL-4 mRNA表达明显下调，仅C+X组T-bet／GATA-3比值上调。关节HE染色后观察显示，C+X组炎症细胞大量浸润，与M组病变程度类似，而C+G组单核细胞浸润减少，病变减轻。TUNEL原位检测关节组织细胞凋亡显示，与C相比较，C+G组细胞凋亡率下降，C+X组未见明显改变，但镜下观察显示C+X组炎症细胞、纤维细胞增加，细胞凋亡加重。综合宏观体征和微观指标，宣痹汤与桂枝芍药知母汤均未明显改善经“风寒湿”干预三周的CIA大鼠病情，反而，宣痹汤使临床症状、关节局部病变，细胞凋亡恶化，且上调了T-bet／GATA-3比值，加剧了Th1／Th2漂移。5．此外，对“风湿热”干预三周后的CIA大鼠，灌胃给予宣痹汤(H+X组)及桂枝芍药知母汤(H+G组)三周，结果显示，仅H+G组大鼠血清Anti-CII抗体水平显著下降，H+G组和H+X组Th1、Th1／Th2均显著降低，Th2显著上升，INF-γmRNA表达均下降，另外，仅H+G组GATA-3 mRNA表达上调，T-bet／GATA-3比值下降。关节HE染色后观察显示，H+G组与H组比较，病变减轻，而H+X组病变仍较重。TUNEL法原位检测关节组织细胞凋亡显示，两组细胞凋亡率均未明显改变。综合宏观体征和微观指标，宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比，在改善经“风湿热”干预三周后的CIA临床症状和微观指标方面，后者要优于前者。综上，“风寒湿”或“风湿热”外界环境干预可导致热痹证CIA大鼠证候改变，并都能改善CIA热痹证大鼠的病情，逆转Th1／Th2漂移，但前者影响更为明显，后者对CIA大鼠关节局部病变无影响。这证明，外界环境对痹证证候演变有一定程度的影响，验证了痹证乃“内外合邪”的病因学理论。另外，宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比，前者与热痹证大鼠的“证候要素”、“病机”更为相符，能更好地治疗CIA热痹证，逆转Th1／Th2漂移，但与寒痹证CIA大鼠的“证候要素”、“病机”相反，使寒痹证大鼠病情恶化，加剧Th1／Th2漂移：桂枝芍药知母汤对寒痹证大鼠病情及Th1／Th2漂移影响不明显，但与热痹证兼夹瘀血因素大鼠的“证候要素”、“病机”更为相符，能更好改善该证型CIA大鼠病情，但二者对Th1／Th2漂移影响相似。这验证了痹证“方证相应”理论中，只有治痹方药与痹证证候之“要素”、“病机”高度相符，该方药才能获得最佳疗效的正确观点。而且，Th1／Th2细胞亚群漂移程度可能是痹证“方证相应”理论中“方”与“证”符合度在细胞水平的物质基础，T-bec／GATA-3 mRNA表达情况，可能是“方”与“证”符合度在分子水平的物质基础。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
英文缩略语  11-12
上篇研究综述  12-60
  综述一类风湿性关节炎的现代研究进展  13-35
    1 RA的发病机理  13-20
    2 RA动物模型  20-24
    3 RA的现代治疗研究进展  24-29
    参考文献  29-35
  综述二 RA的中医药现代研究进展  35-53
    1 病因病机研究进展  35-36
    2 RA的中医证候学现代研究进展  36-39
    3 RA的中医药治疗研究进展  39-43
    4 中医药治疗RA的机制研究进展  43-47
    5 展望  47
    参考文献  47-53
  综述三 RA Th1/Th2细胞亚型漂移的现代研究进展  53-60
    1 T细胞亚型的分类  53
    2 Th1细胞相关的转录因子  53-54
    3 Th2细胞相关的转录因子  54-55
    4 T-bet/GATA-3与Th1/Th2平衡  55-57
    5 展望  57
    参考文献  57-60
中篇理论研究  60-76
  第1部分历代医家痹证证治探析  61-68
    前言  61
    1 《内经》时期  61-62
    2 东汉时期  62-64
    3 隋唐时期  64-65
    4 金元时期  65-66
    5 明代  66-67
    6 清代  67
    结语  67-68
  第2部分痹证"方证相应"探析  68-76
    前言  68
    1 “方证相应”的提出  68-69
    2 “方证相应”的逻辑内涵  69-71
    3 “方证相应”与“同证异方”、“同方异证”的命题思考  71-73
    4 痹证与“方证相应”  73-76
下篇实验研究  76-137
  前言  77-79
  实验1 CIA模型的制备与评估  79-85
    1 材料  79
    2 方法  79-81
    3 结果  81-83
    4 讨论  83-84
    5 结论  84
    6 参考文献  84-85
  实验2 风寒湿或风湿热干预对CIA热痹证大鼠证候影响的比较研究  85-94
    1 材料  85
    2 方法  85-87
    3 结果  87-90
    4 讨论  90-92
    5 参考文献  92-94
  实验3 风寒湿或风湿热干预对CIA热痹证大鼠T细胞亚型漂移影响的比较研究  94-104
    1 材料  94-95
    2 方法  95-96
    3 结果  96-101
    4 讨论  101-102
    5 参考文献  102-104
  实验4 桂枝芍药知母汤或宣痹汤干预对CIA热痹证大鼠证候及T细胞亚型漂移影响的比较研究  104-115
    1 材料  104
    2 方法  104-106
    3 结果  106-112
    4 讨论  112-114
    5 参考文献  114-115
  实验5 桂枝芍药知母汤或宣痹汤对风寒湿干预后"寒痹证"CIA大鼠证候和T细胞亚型漂移影响的比较研究  115-126
    1 材料  115
    2 方法  115-116
    3 结果  116-123
    4 讨论  123-126
  实验6 桂枝芍药知母汤或宣痹汤对风湿热干预后CIA大鼠证候和T细胞亚型漂移影响的比较研究  126-137
    1 材料  126
    2 方法  126-127
    3 结果  127-134
    4 讨论  134-136
    5 参考文献  136-137
讨论  137-144
结论  144
创新点  144-145
致谢  145-146
个人简历  146

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