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GSTM3基因调控区单核苷酸多态性与原发性高血压和高脂血症的关联研究及功能鉴定

作　者: 刘健
导　师: 赵彦艳
学　校: 中国医科大学
专　业: 遗传学
关键词: 原发性高血压高脂血症 GSTM3 单核苷酸多态性关联研究电泳泳动迁移分析 TATA框
分类号: R589.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

前言原发性高血压（Essential Hypertension，EH）是一种最常见的心血管疾病，是动脉粥样硬化、脑中风和肾衰的主要危险因素之一。然而，EH发生和发展与高脂血症密切相关。高脂血症指各种原因导致的血浆中总胆固醇和／或甘油三脂水平升高的一类疾病。脂质代谢异常，其主要危害是引起动脉粥样硬化，进而造成相应器官或组织供血不足，导致冠心病、脑缺血、脑梗塞及周围血管病变。EH和高脂血症是由遗传因素和环境因素共同作用的多基因病。因此，对这两种疾病候选基因的关联研究和功能鉴定，有助于阐明他们的致病机制。谷胱甘肽-S-转移酶是一种具有多种生理功能的同工酶家族。谷胱甘肽-S-转移酶M3为此酶家族成员之一，是保护机体免受氧化物损伤的主要代谢酶。此酶具有谷胱甘肽过氧化物酶活性，可以催化谷胱甘肽与多种活性氧和自由氧基等多种反应性中间产物结合，生成可溶性的GSH结合产物，表现出较强的抗氧化应激功能。而氧化应激在冠心病、动脉粥样硬化和EH等心血管疾病的病理发生过程中起着重要的作用。迄今为止报道的高血压候选基因至少有150种，其中包括血管活性多肽及其受体基因、生长因子和细胞因子及其受体基因、盐敏感基因及离子通道、细胞增殖和凋亡相关基因、应激分子和细胞外基质、转录因子和发育相关因子、粘附分子及其受体和收缩蛋白细胞骨架等基因，其病理发生的分子机制仍在深入研究中。最近，Aoharu Iwai等对日本人群的GSTM3两个单核苷酸多态（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）位点（A3207G和C-1305G）进行了分析，结果显示日本女性个体的这两个SNP位点与高血压具有较强的相关性（p₁=0.0094；p₂=0.0063）。关于GSTM3的A-63C位点多态性与EH和高脂血症的关联分析尚未见报道。本研究以病例—对照人群为基础，进行了GSTM3的调控区A-63C位点SNP与EH和高脂血症的关联研究。同时，还应用软件预测、萤光素酶报告基因表达载体的活性检测和电泳泳动迁移分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）方法对GSTM3调控区A-63C位点SNP的功能进行了分析鉴定，以明确GSTM3在EH和高脂血症致病机制中的作用。材料与方法一、实验材料1、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂2、JM109感受态细胞3、人类肝癌Bel细胞4、电泳泳动迁移实验（EMSA）相关试剂5、所有研究对象均来自辽宁省西部彰武县高血压高发区汉族人群。随机选取高血压组、高脂血症组和正常对照组共计878人，无血缘关系。高血压组：234例（男99人，女135人）收缩压（Systolic Blood Pressure，SBP）≥140mmHg和（或）舒张压（Diastolic Blood Pressure，DBP）≥90 mmHg，排除继发性高血压，无服用抗高血压药物史；高脂血症组：316例（男99人，女217人），总胆固醇≥5.7 mmol／L和（或）甘油三脂≥1.70 mmol／L；正常对照组：328人（男100人，女228人），血压＜140／90 mmHg；总胆固醇＜5.7 mmol／L和甘油三脂＜1.70 mmol／L。二、实验方法1、饱和氯化钠法提取基因组DNA，应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法扩增GSTM3调控区（-427bp～+40bp）DNA片段。应用限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）方法进行A-63C多态性的基因型分析。随机选取病例—对照人群中的20个PCR产物进行DNA测序验证。2、构建GSTM3调控区含A-63C多态的萤光素酶报告基因表达载体（pGL3-GSTM3），脂质体法转染人类肝癌Bel细胞，应用萤光素酶试剂盒检测萤光素酶活性。用不同浓度的酒精对Bel细胞进行刺激，检测酒精对GSTM3表达的影响。3、应用电泳泳动迁移分析实验鉴定GSTM3调控区转录因子结合元件。提取Bel细胞核蛋白。设计合成GSTM3的含A-63C多态位点的寡核苷酸序列，经复性和末端标记后制成探针，与Bel细胞核蛋白混合，冰上结合30分钟后进行电泳和放射自显影检测。应用不同浓度的酒精（100mmol／L，150mmol／L）对Bel细胞进行处理后，重复以上实验步骤，以检测酒精对反应元件的作用。4、x²检验用于计数资料的关联分析和Hardy-Weinberg平衡检验，t-检验用于临床指标差异的显著性判定。Logistic回归分析用于确定高血压和高脂血症患病风险因素。各临床指标以均值±标准差表示。所有统计学运算由SPSS 12.0软件完成。结果1、在高血压病例—对照人群中，除了收缩压和舒张压EH组明显高于对照组（p＜0.001）外，EH组体重指数、甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白水平均高于对照组（p＜0.001）。高血压病例—对照关联研究结果显示，-63C等位基因在EH组的频率（20.4％）高于对照组（14.8％）（x²=3.419，p=0.042）。-63CC基因型在EH组的分布频率（6.0％）也明显高于对照组（1.8％）（x²=6.92，p=0.011）。在女性个体中，CC基因型在高血压组的分布频率（6.7％）明显高于对照组（0.9％），有统计学差异（x²=8.04，p=0.005）。此外，-63CC基因型个体的收缩压、舒张压、总胆固醇、低密度脂蛋白和血清钠明显高于其他基因型个体（p＜0.05）。2、在高脂血症病例—对照人群中，除了总胆固醇和甘油三脂高脂血症组明显高于对照组（p＜0.001）外，高脂血症组的体重指数、收缩压、舒张压、低密度脂蛋白和血清钠水平明显高于对照组（p＜0.001）。在女性个体中，CC基因型在高脂血症组的分布频率（4.6％）明显高于对照组（0.4％），差异有显著性（OR=5.459，95％CI：1.182～8.206，x²=5.899，p=0.018）。Logistic回归分析结果显示GSTM3调控区-63CC基因型是高脂血症的独立危险因素之一，携带该基因型的个体患病风险高（调整后的OR=2.78，95％CI：：1～7.69，p=0.045）。此外，-63CC基因型个体的总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白和血清钙明显高于其他基因型个体（p＜0.05）。3、构建了包含GSTM3调控区A-63C位点的单拷贝不同长度的pGL3萤光素酶报告基因表达载体（pGL3-636A、pGL3-636C、pGL3-970A和pGL3-970C）。瞬时转染后，检测报告基因的表达。检测结果显示，这四种DNA片段均具有转录活性，同时，pGL3-636A转录活性是pGL3-636C的9.9倍，两者间有显著性差异（p＜0.05）。另外，pGL3-970A转录活性是pGL3-970C的5.7倍，两者间有统计学差异（p＜0.05）。同时，中低浓度的酒精刺激Bel细胞后，pGL3-636A的转录活性增强（p＜0.05），而pGL3-636C的转录活性无明显变化。4、软件预测分析显示A-63C位点附近存在潜在的EFII和TATA框，EMSA实验结果发现TATA-a探针与核蛋白的结合带要比TATA-c的强，说明此多态位点能够改变转录因子与TATA框的结合活性。当应用不同浓度的酒精处理时，TATA-a探针与转录因子的结合活性随着酒精浓度的升高而上调。结论1、GSTM3调控区存在的A-63C多态性与原发性高血压相关联。在女性个体中，A-63C多态性与高脂血症相关联，CC基因型是高脂血症发生的危险因素之2、GSTM3调控区A-63C多态位点改变了转录因子与TATA框的结合活性。含63A调控序列的转录活性明显高于-63C（p＜0.05）。3、酒精刺激可以提高pGL3-636A的转录活性（p＜0.05），但是对pGL3-636C转录活性影响不大。4、GSTM3可能是EH和高脂血症致病基因之一，多种环境致病因子可能通过TATA框调控途径引起不同基因型个体的GSTM3表达水平不同，及对EH与高脂血症易感性的差异。

全文目录

一、摘要  5-14
  中文论著摘要  5-9
  英文论著摘要  9-14
二、英文缩略语  14-16
三、论文  16-59
  论文一  16-37
    前言  16-17
    实验材料  17-18
    实验方法  18-20
    实验结果  20-32
    讨论  32-36
    结论  36-37
  论文二  37-59
    前言  37-38
    实验材料  38-40
    实验方法  40-47
    实验结果  47-55
    讨论  55-58
    结论  58-59
四、本研究创新性的自我评价  59-60
五、参考文献  60-64
六、附录  64-74
  综述  64-72
  在学期间科研成绩  72-73
  致谢  73-74
  个人简介  74

GSTM3基因调控区单核苷酸多态性与原发性高血压和高脂血症的关联研究及功能鉴定

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