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贲门癌和远端胃癌中染色体18q区域杂合性丢失的差异研究

作　者: 徐岩
导　师: 徐惠绵
学　校: 中国医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 贲门癌 远端胃癌 杂合性丢失 染色体18q SMAD4
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的从解剖学的角度来说，贲门(cardia)属于胃的一部分。贲门癌(Adenocarcinoma of gastric cardia，AGC)即来源于贲门粘膜的癌。但目前的证据表明，贲门癌与其它部位的胃癌，在流行病学、生物学行为和临床特点上有着显著的不同。这也提示贲门癌可能是一种相对独立的临床疾病，具有其独特的发病机制。近年的研究发现，贲门癌中4q、18q、5q等染色体区域的异常丢失较为常见。根据knudson的“二次打击”假说，这些染色体区域内可能存在着与贲门癌密切相关的抑癌基因(Tumor suppressor gene，TSG)。为了更加深入地了解贲门癌和胃癌的分子生物学特征，揭示贲门癌的发病机制，本研究系统地考察了贲门癌和远端胃癌(Adenocarcinoma of distal stomach，ADS)中染色体18q区域内的杂合性丢失(Loss of heterozyosity，LOH)情况。我们首先利用激光捕获显微切割(Laser capture microdissection，LCM)技术对取自临床的肿瘤标本进行显微切割，分别获取均质的癌细胞和相应的正常胃粘膜细胞；然后利用多重置换扩增(Multiple displacement amplification，MDA)技术对LCM捕获细胞的基因组DNA进行全基因组扩增(Whole genome amplification，WGA)；进而以WGA产物为实验材料进行LOH分析。本研究中，我们选择了覆盖染色体18q区域的11个微卫星多态标记位点，应用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色的方法，分析了20例AGC和36例ADS的LOH情况。并根据实验发现，进一步考察了SMAD4基因在两种肿瘤中的丢失情况以及SMAD4蛋白的表达情况。力图定位与AGC和ADS密切相关的染色体区域，进而为发现新的抑癌基因提供方向。材料与方法1、获取均质的癌细胞和相应的正常胃粘膜细胞20例AGC和36例ADS均来自临床手术切除标本。分别切取正常胃粘膜和原发癌灶，OCT包埋，液氮中保存。8μm厚连续冷冻切片，按NIH推荐程序行HE染色。利用LM200型LCM系统，分别获取正常胃粘膜细胞、原发灶癌细胞各约5000个。2、提取LCM捕获细胞的基因组DNA将载有细胞的塑料帽置于预先加有30μl DNA裂解缓冲液的离心管，37℃水浴16h。3、全基因组多重置换扩增按照Genomiphi WGA Kit(Amersham Bioscience Corp.,USA)说明书进行MDA扩增。每份样品重复两次，将两次扩增产物混匀，稀释20倍后用于LOH分析。4、微卫星标记的选择利用UCSC人类基因组注释数据库和Marshfield数据库，选取覆盖染色体18q的11个微卫星多态标记，其中3个微卫星多态标记位于SMAD4基因序列的两翼。5、LOH分析以全基因组扩增后的产物为模板，用PCR方法扩增所选择的微卫星标记位点。PCR反应体系为10μl，其中包括10×Ex Taq缓冲液1μl、2.5 mmol／L dNTPs 0.8μl、Ex Taq 0.05μl、10μmol／L的引物混合物0.8μl，MDA产物0.5μl。PCR扩增的热循环条件为：94℃变性1 min后，94℃30s，退火75s，72℃15s，重复30个循环，最后72℃延伸6min。经琼脂糖电泳检测后，取2μl PCR产物与8μl变性终止液混合，98℃变性8min，冰上冷却5min。上样于8％变性聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳。电泳条件为：500v电压，室温下，电泳2.5小时。电泳结束后，根据标准的硝酸银染色方法进行染色。6、LOH的判定将肿瘤组织与其相应的正常细胞基因组DNA的电泳结果相比较，若肿瘤样品某一等位基因条带消失或相对密度减少70％以上，则判为LOH。其中纯合子个体(即该微卫星位点在正常细胞中只显示一个电泳条带)判为无信息病例，不列入结果分析。有信息的杂合子病例为该微卫星位点在正常细胞中显示两个条带。7、免疫组织化学方法检测SMAD4蛋白的表达情况SP法检测20例AGC和36例ADS中SMAD4蛋白的表达情况。另增加其它部位的胃癌蜡块标本47例，其中胃底部癌10例，胃体部癌28例，胃窦部癌9例。标本蜡块取自病理科，癌灶和癌旁正常组织分别作连续切片，厚4μm。鼠抗人SMAD4单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。8、统计学分析分析ADS和AGC之间各个微卫星标记的LOH差异，以及LOH与临床病理特征之间的关系，所用统计学方法为双侧Fisher检验。分析SMAD4蛋白的表达情况与临床病理特征之间的关系用x~2分析。P＜0.05被认为统计学上有显著意义，所用的统计软件为SPSS 11.0。实验结果1、染色体18q LOH分析的结果20例AGC中，有10例(50.0％)存在一个或多个位点的LOH。位点D18S858的LOH检出频率最高，为54.5％(6／11)，其位于染色体18q21.31。另外还有四个微卫星标记的丢失频率大于30％，即D18S1357(41.7％，5／12)、ATA82B02N(33.3％，3／9)、D18S1364(33.3％，5／15)和D18S535(30.8％，4／13)，见表1-3。根据染色体的丢失情况，我们确定了一个共同丢失区域，位于位点D18S858、D18S1357、D18S1364(LOH检出频率分别为54.5％、41.7％和33.3％)。这个区域的遗传距离为19厘摩(cM)。在发生LOH的10例AGC样品中，有8例在这个区域内存在着丢失。36例ADS中，有19例(52.7％)存在一个或多个位点的LOH。位点D18S535的LOH检出频率最高，为37.5％(9／24)，其位于18q12.3。另外还有两个微卫星标记的丢失频率大于30％，即D18S858(36.8％，7／19)和D18S1364(31.8％，7／22)，它们分别位于染色体18q21.2和18q22.1。根据染色体的丢失情况，我们确定了两个共同丢失区域，第一个共同丢失区域定位于位点ATA82B02N和D18S1371(LOH检出频率分别为28.6％和30.0％)，这个区域的遗传距离为9厘摩(cM)。在发生LOH的15例ADS样品中，11例在这个区域内有丢失。第二个共同丢失区域位于位点D18S851、D18S858和D18S1357(LOH检出频率分别为23.5％，36.8％和22.7％)，这个区域的遗传距离为13.7厘摩(cM)。在发生LOH的15例ADS样品中，有11例在这个区域内有丢失。2、AGC与ADS之间染色体18q区域LOH的差异通过对比AGC和ADS中18q的LOH作图结果，我们发现两肿瘤中染色体18q的丢失区域并不一致。ADS的丢失区域为18q21.1-21.32和18q22.2-22.3。而AGC为18q21.2-22.1。AGC中大部分微卫星标记的丢失频率高于ADS，但二者的差异无统计学意义。微卫星标记D18S858的LOH与AGC的关系似乎更加密切些，但ADS与AGC在这个位点的丢失频率差异并无统计学意义(P=0.283，7／19 vs6／11)。3、SMAD4基因LOH分析的结果我们分析了36例ADS中SMAD4基因两侧3个微卫星标记的LOH情况，其中有13例(33.3％)存在一个或多个位点的LOH。其中240号标本在3个位点均出现了LOH，262号和283号标本在2个位点(D18S816和D18S1110)出现了LOH。位点D18S816的LOH检出频率最高为30.4％，位点D18S1110和CTTT分别为26.1％和21.1％。20例AGC中只有2例(10％)存在LOH，分别是84号标本在D18S816位点，以及133号标本在D18S1110位点。位点CTTT上没有发现LOH。4、SMAD4蛋白表达的结果AGC中SMAD4蛋白正常表达阳性率为75.0％(15／20)，而ADS中SMAD4蛋白正常表达阳性率则为47.2％(17／36)。两者间有显著性差异(P＜0.05)。若将后增加的47例胃癌也列入统计分析，则不同部位胃癌中SMAD4蛋白表达阳性率分别为贲门75.0％(15／20)，胃底50.0％(5／10)，胃体53.6％(15／28)，胃窦46.7％(21／45)。虽然从总体上看各个部位的肿瘤在蛋白表达上没有显著差异，但贲门部癌的表达阳性率明显高于非贲门部癌(P＜0.05)。结论1．本研究联合应用激光捕获显微切割和多重置换扩增技术，较为系统地研究了20例AGC和36例ADS中染色体18q区域的LOH情况。发现染色体18q区域的LOH在AGC和ADS中均高发，丢失频率分别为50.0％和52.7％。2．本研究定位了两个与ADS密切相关的染色体共同丢失区域，即18q21.1-21.32和18q22.2-22.3，一个与AGC密切相关的染色体共同丢失区域18q21.2-22.1。这些区域内可能分别存在着与ADS和AGC相关的一个或多个抑癌基因。3．我们的结果显示已知抑癌基因SMAD4位于ADS的染色体共同丢失区域，这与以往的研究结果一致，但SMAD4并不位于AGC的染色体共同丢失区域。通过进一步考察SMAD4基因在ADS和AGC中LOH和蛋白表达情况，我们发现ADS中存在着较高频率的SMAD4基因LOH和蛋白表达下降。而AGC中出现SMAD4基因LOH和蛋白表达下降的频率要显著地低于ADS(P＜0.05)，提示SMAD4基因与AGC的关系可能不像ADS那么密切。4．染色体18q区域内可能存在着尚未被发现的、与AGC关系密切的抑癌基因。5．ADS和AGC具有不同的分子遗传学特征，两者可能是不同的临床疾病。

全文目录


一、论文摘要  6-16
  中文论著摘要  6-11
  英文论著摘要  11-16
二、英文缩略语  16-17
三、论文  17-50
  论文一 贲门癌与远端胃癌中染色体18q区域杂合性丢失的研究  17-32
    前言  17-18
    材料与方法  18-23
    实验结果  23-28
    讨论  28-31
    结论  31-32
  论文二 SMAD4在贲门癌与远端胃癌中LOH和蛋白表达情况的研究  32-42
    前言  32-33
    材料与方法  33-36
    实验结果  36-40
    讨论  40-41
    结论  41-42
  论文三 PIK3CA和YY1基因在胃癌中突变情况的研究  42-50
    前言  42-43
    材料与方法  43-46
    实验结果  46-48
    讨论  48-49
    结论  49-50
四、本研究创新性的自我评价  50-51
五、参考文献  51-58
六、附录  58-69
  综述  58-67
  在学期间科研成绩  67-68
  致谢  68-69
  个人简介  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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