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smad4及Wnt3a对MSCs的miRNA谱的影响

作　者: 李鹏
导　师: 雪原
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞重组腺病毒 Wnt3a smad4 miRNA 成骨
分类号: R580
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 57次
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内容摘要

目的：用Wnt3a和smad4联合刺激纯化的MSCs,观察其miRNA谱的变化,为寻找成骨相关的miRNA提供实验基础。方法：选用出生后2周的SD大鼠,无菌下其股骨的骨髓细胞,通过分离、培养原代骨髓间充质干细胞；绘制其生长曲线；流氏细胞仪检测培养第6代的、已纯化的骨髓间充质干细胞。通过pcDNA3.1-smad4与穿梭质粒pGStrack-HB组装,依靠同源性将穿梭质粒pGStrack-smad4转移至pGSadeno腺病毒表达载体上；HEK 293包装重组腺病毒及线性化,完成pGSadeno-smad4的构建；PCR验证重组腺病毒的产生。以rAd5-smad4转染和Wnt3a联合刺激培养MSCs,激光共聚焦观察Wnt3a+smad4组β-cat/Smad4在MSCs内的聚合现象。Trizol法提取细胞中的总RNA,制作芯片,用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片。采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析。用Significance Analysis of Microarrays检测Wnt3a+smad4对MSCs的miRNA普表达的影响,挑选出差异表达基因。并观察MSCs的存活时间及凋亡结果：经过分离、培养的原代骨髓间充质干细胞,经多次传代后,细胞逐渐纯化,并且细胞初期多以集落形式增长,第6代后细胞呈形态均一的纺锤形,分布均匀。流式细胞仪检测,结果显示为体积均一的细胞群,CD31、CD34、CD45的阳性率分别为5.67%、4.31%、4.42%,CD90、CD44、CD71的阳性率分别为97.17%、98.63%、95.86%。结果说明本试验培养分离的细胞具备了所有MSCs的抗原特性,细胞生长速率及形态正常。通过穿梭质粒、线性切割和包装构建rAd5-smad4; rAd5-smad4中smad4PCR片段大小约为1.8kb,结果均符合预期,说明重组腺病毒rAd5-smad4包装成功。以rAd5-smad4转染和Wnt3a联合刺激培养MSCs, microarry检测发现hsa-miR-122a、638、494、450表达上调；激光共聚焦显示MSCs内的β-cat/Smad4聚合。]Ad5-smad4转染和Wnt3a联合刺激后MSCs可存活2周/代；凋亡率0.02%。MSCs未经传代长期存活。并具有正常细胞的凋亡率结论：本试验分离、培养的细胞具备了所有MSCs的抗原特性,细胞生长速率及形态正常。通过穿梭质粒、线性切割和包装细胞系完成了rAd-smad4的构建表达；Wnt3a和转染rAd-smad4实现了联合对MSCs进行基因修饰目的,MSCs可存活2周/代；凋亡率0.02%。联合刺激后的MSCs高表达hsa-miR-122a、638、494、450。这为寻找成骨相关的miRNA提供了实验基础。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
缩略语/符号说明  9-10
前言  10-13
  研究现状、成果  10-12
  研究目的、方法  12-13
smad4及Wnt3a对MSCs的miRNA谱的影响  13-42
  材料和方法  13-28
  结果  28-35
  讨论  35-42
结论  42-43
参考文献  43-48
发表论文和参加科研情况说明  48-49
综述 Wnt信号途径在骨形成中的作用  49-62
  综述参考文献  57-62
致谢  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病
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