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颅脑损伤后代谢型谷氨酸受体1a（mGluR1a）表达及竞争性拮抗剂1-氨基茚-1，5-二羧酸（AIDA）作用研究

作　者: 曹飞
导　师: 刘伟国
学　校: 浙江大学
专　业: 外科学
关键词: 神经元损伤模型细胞培养谷氨酸拮抗剂大鼠弥漫性脑损伤 mGluR1a 神经功能评分
分类号: R651.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

颅脑损伤后代谢型谷氨酸受体1a（metabotropic glutamate recep tor 1，mGluR1a）表达及竞争性拮抗剂1—氨基茚—1，5—二羧酸（AIDA）作用研究颅脑损伤是神经外科常见疾病之一，其发病率及致死、致残率均较高，是危害身心健康的主要疾病之一。急性脑创伤后神经元损伤可分为两种形式，一种称为原发性神经元损伤，是损伤暴力对神经元的机械损伤，在创伤的同时发生；另一种称为迟发性神经元损伤，主要表现为兴奋性毒性死亡和凋亡两种形式，由多种因素引起，在创伤后几小时、几天甚至更长时间后发生。谷氨酸（Glu）是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质之一，颅脑损伤可引起Glu的过量释放，激活Glu受体。Glu通过离子型谷氨酸受体（iGluRs）和代谢性谷氨酸受体（mGluRs）作用于神经元。但目前的研究主要集中在iGluRs，而关于m GluRs在脑损伤病理生理中的作用却知之甚少。代谢型谷氨酸受体是一类与G蛋白耦联的调节离子通道和第二信使生成酶的特异受体，存在的多种亚型反映出它们在功能上的多样性和复杂性，不同亚型的受体具有不同的胞内信号转导机制。它们对谷氨酸介导的突触传递的调节作用可以表现为增强作用，也可以表现为抑制效应，最终效应取决于局部神经环路的构成。依据mGluRs序列同源性信号传导机制和药理学敏感性将该受体分为3组共8种亚型，第1组包括mGluR1（mGluR1a、b、c、d、e）和mGluR5（mGluR5a和b），与Gq蛋白偶联；第Ⅱ组受体包括mGluR2和mGluR3，与Gi蛋白偶联；第Ⅲ组谷氨酸受体包括mGluR4（mGluR4a和4b），mGluR6，mGluR7（mGluR7a和7b）和mGluR8（：mGluR8a和8b），与Gi蛋白偶联。一系列研究显示，大鼠弥漫性脑损伤后脑皮层内3组mGluRs表达均有改变但以mGluR1变化最为显著，是加重神经元损伤的主导因素。mGluR1激活后通过使PLC活化，促使磷脂酰肌醇（PI）水解为三磷酸肌醇（IP3）与二酰基甘油（DAG），二者均为胞内信号转导的第二信使。多年来学者们致力于颅脑损伤生理病理机制、实验性治疗的研究，建立了多种在体及体外颅脑损伤模型。由于体外研究模型能够排除体内损伤过程中一些复杂因素的影响，并具有能够选择性的观察单因素对某种类型细胞的影响的优点，近年来日益受到研究者的重视。在本实验中我们建立了一种新的体外培养大鼠脑皮层神经元机械损伤模型，并在该模型的基础上探讨损伤前后mGluR1a的表达及其拮抗剂AIAD的作用和意义。此外，我们在自由落体损伤模型的基础上探讨伤后不同时间大鼠大脑皮层m GluR1a表达的变化及其拮抗剂AIAD的作用和意义。实验共分三个部分：第一部分体外培养大鼠皮层神经元机械性损伤模型的建立目的介绍一种较为简单的皮层神经元培养方法并在此基础上建立体外培养大鼠皮层神经元机械性损伤模型。方法出生24小时以内的SD大鼠皮层神经元体外培养，针头机械性划伤培养的皮层神经元，依划伤程度不同分为轻度和重度损伤2组，对照组除不进行划伤处理外，其余处理同损伤组。伤后不同时间点检测皮层神经元存活率及培养液上清乳酸脱氢酶（LDH）含量。结果培养的皮层神经元生长良好，损伤的体外培养大鼠皮层神经元出现变性及坏死等改变；伤后30分钟起，各损伤组神经元存活率较均对照组明显下降，且随损伤程度加重，神经元存活率随之降低（P＜0.05）；伤后30分钟起，损伤组培养液上清LDH活性较对照组明显增加（P＜0.05）。结论体外培养大鼠皮层神经元机械性损伤模型操作简便，重复性好，能模拟颅脑损伤后神经元损伤过程，可控制损伤程度；是一种较好的体外神经元机械性损伤模型。第二部分皮层神经元机械性损伤后mGluR1a的表达规律及其竞争性拮抗剂AIDA的保护作用目的：研究体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤后mGluR1a的表达规律及其竞争性拮抗剂AIDA的保护作用。方法：出生24小时以内的SD大鼠皮层神经元体外培养7天，随机分为创伤组和AIDA组：以针头造成细胞机械性损伤，AIDA处理组在损伤前30分钟每孔加入AIDA200μmol；RT—PCR和Western blotting法检测损伤前后体外培养皮层神经元mGluR1a的表达；伤后不同时间点行神经元免疫组化染色；伤后不同时间点留取创伤组及治疗组培养液上清检测LDH含量；采用Fura—2／AM双波长荧光法测定损伤前后神经元细胞内游离Ca²⁺浓度变化，同时测定接受AIDA治疗的神经元细胞内游离Ca²⁺浓度。结果：RT—PCR和Western blot检测结果显示mGluR1a在未损伤皮层神经元的表达；伤后1小时起m GluR1a mRNA的表达明显升高，在伤后1至12小时较对照组明显增加（P＜0.05）；免疫组化染色发现未损伤神经元mGluR1a表达呈弱阳性，染色颗粒分布于胞浆、胞膜及突起，机械性损伤后30min起，mGluR1a阳性细胞明显增多（P＜0.05）；伤后12小时起AIDA处理组LDH活性较单纯损伤组明显降低（P＜0.05）；损伤后神经元细胞内游离Ca²⁺浓度较损伤前明显升高（P＜0.05），伤后1小时AIDA处理组较单纯损伤组神经元细胞内Ca²⁺浓度明显降低（P＜0.05）。结论：体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤后mGluR1a表达明显增强，创伤引起的神经细胞内游离Ca²⁺浓度升高可被mGluRs1a拮抗剂AIDA阻断，AIDA有显著的神经保护作用。第三部分：急性弥漫性脑损伤后神经元mGluR1a的表达规律及其竞争性拮抗剂AIDA的保护作用目的：研究大鼠急性脑损伤后大脑皮层mGluR1a的基因表达变化与其拮抗剂AIDA的作用。方法：SD大鼠随机分为假手术组、单纯损伤组、生理盐水治疗组（NS）和AIDA治疗组共4组，参照Marmarou自由落体方法制作弥漫性脑损伤（DBI）模型，治疗组大鼠在损伤前30分钟经侧脑室注射生理盐水或AIDA溶液10μl；假手术组和单纯打击组大鼠在伤后不同时间断头取脑进行RT—PCR、HE染色、脑组织含水量测定和免疫组化研究；治疗组大鼠伤后不同时间断头取脑进行脑组织含水量测定和免疫组化研究，在伤后1天、1周及2周进行大鼠神经功能评分（NSS）。结果：假手术组大鼠m GluR1a mRNA表达较少，损伤组m GluR1a mRNA在伤后24h达到高峰，随后逐渐减少，伤后1至48小时较假手术组明显增加（P＜0.05）；伤后1小时起损伤组大鼠脑组织含水量较假手术组明显升高，在伤后24 h达到高峰，伤后1周恢复正常；DBI组大鼠伤后1 h至1周大脑皮层m GluR1a阳性神经元弥漫性增加（P＜0.05），在伤后24 h达到高峰。与NS组大鼠相比，AIDA组大鼠伤后12～72小时脑组织含水量较NS组明显下降（P＜0.05）；伤后1天及一周AIDA治疗组大鼠神经功能无明显改善（P＞0.05），伤后两周AIDA治疗大鼠组神经功能有明显改善（P＜0.05）。结论：mGluR1a参与脑外伤后的继发性神经元损伤，其竞争性拮抗剂AIDA可改善损伤大鼠预后，对急性脑损伤具有治疗作用。

全文目录

常用英文缩写词表  4-5
中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
实验设备  14-16
常用试剂配方  16-18
第一部分体外培养大鼠皮层神经元机械性损伤模型的建立  18-29
  前言  18
  材料和方法  18-21
  结果  21-25
  讨论  25-26
  参考文献  26-29
第二部分皮层神经元机械性损伤后mGluR1a的表达规律及其竞争性拮抗剂AIDA的保护作用  29-47
  前言  29
  材料与方法  29-35
  结果  35-41
  讨论  41-43
  参考文献  43-47
第三部分:急性脑创伤后神经元mGluR1a的表达规律及其竞争性拮抗剂AIDA的保护作用  47-63
  前言  47
  材料和方法  47-52
  结果  52-58
  讨论  58-59
  参考文献  59-63
全文小结  63-64
综述中枢神经系统内代谢型谷氨酸受体  64-88
  正文  64-79
  参考文献  79-88
附录  88-89
  博士研究生在读期间发表的研究论文  88-89
致谢  89

颅脑损伤后代谢型谷氨酸受体1a（mGluR1a）表达及竞争性拮抗剂1-氨基茚-1，5-二羧酸（AIDA）作用研究

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