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细菌人工染色体（BAC）介导的人α-珠蛋白基因簇转基因小鼠的研究

作　者: 冯东晓
导　师: 梁植权；刘德培
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 转基因小鼠珠蛋白转基因鼠染色体介导研究生论文医科大学转基因动物基因簇表达水平外源基因
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

人类珠蛋白基因家族分为α和β两个基因簇。位于第11号染色体短臂上的β-珠蛋白基因簇以5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′顺序排列；位于第16号染色体短臂上的α-珠蛋白基因簇以5′-ζ-ψζ-ψα2- ψα1-α₂-α₁-θ-3′顺序排列，其中ζ为胚胎型功能基因，α为胎儿型和成年型功能基因。全长约40kb；除α-珠蛋白基因簇中的部分具有多态性的重复序列外，这两个基因簇的DNA序列已基本测定。珠蛋白基因在个体发育中表现为依次表达，并具有高度的组织特异性和发育阶段特异性，两类珠蛋白基因的终产物间始终维持平衡。珠蛋白基因的转录受多种因素的影响，其中α-珠蛋白基因簇的主要增强子HS-40位于ζ-珠蛋白基因的上游大约40kb的位置，对于簇内各个珠蛋白基因在红系组织细胞中的高表达是必需的。转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组中稳定整合并能遗传给后代的一类动物。利用转基因动物可以在分子水平设计实验，从四维时空观察转基因的整体效应。利用转基因动物技术可以建立人类疾病相关基因的转基因动物模型，以探讨异常基因的表达调控规律。大容量载体技术可以模拟机体天然染色质微环境，克服小片段重组体转基因实验中忽略基因间或调控元件之间相互作用的缺陷，从而研究大片段基因簇的表达调控规律。近年发展起来的建立在大肠杆菌F因子基础上的细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome，BAC）遗传特性稳定，不易发生缺失和重组：制备和纯化方法简便快速；可直接进行DNA测序分析；载体上的稀有限制性内切酶NotI位点可以方便地线性化BAC DNA并去除载体片段。本研究利用从人类基因组BAC文库中筛选出的含人α-珠蛋白基因簇的BAC克隆191k2，首先对该克隆进行了末端直接测序和染色体原位荧光杂交（FISH）以排除嵌合体的可能性。大量提取并纯化BAC DNA后，用NotI酶切分离出含完整人α-类珠蛋白基因簇的插入片段，利用Sepharose CL-4B柱凝胶过滤层析快速分离插入DNA片段和载体DNA，选择合适浓度的DNA经显微注射制作转基因小鼠，获得了4个独立的包括完整人α-珠蛋白基因座位的转基因鼠株系。RNase保护实验检测结

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
一.前言  12-18
二.材料与方法  18-42
  (一) 材料  18-20
    1.BAC克隆  18
    2.菌株与质粒  18-19
    3.实验用小鼠  19
    4.限制性内切酶与修饰酶  19
    5.其它主要试剂  19
    6.放射性核素  19
    7.主要仪器设备  19-20
  (二) 实验方法  20-42
    1.含完整的人α-珠蛋白基因簇的BAC DNA的鉴定  20-21
    2.利用同源重组修饰BAC DNA  21-28
      2.1 技术路线  22-23
      2.2 穿梭载体的构建  23-26
      2.3 感受态细胞的制备  26
      2.4 细胞的转化和正筛选  26
      2.5 负筛选  26-27
      2.6 Southern杂交鉴定突变体  27-28
    3.显微注射用BAC DNA的制备与纯化  28
    4.受精卵培养基的配制与保存  28-29
    5.小鼠的选择与处理  29-31
    6.超排卵和卵  31
    7.显微注射  31-33
    8.输卵管移卵  33-35
    9.鼠尾基因组DNA的提取  35
    10.PCR和Southern杂交鉴定转基因鼠  35-36
    11.转基因鼠传代  36
    12.胚胎小鼠器官组织的采集和保存  36
    13.阳性胎鼠的PCR快速鉴定  36-37
    14.组织RNA提取  37
    15.RPA检测转基因小鼠中人α-珠蛋白转基因的表达  37-39
    16.转基因鼠血液中人α-珠蛋白的检测  39-42
三.实验结果  42-71
  (一) 含人α-珠蛋白基因簇BAC克隆的进一步鉴定结果  42-43
    1.BAC DNA的末端直接测序结果  42
    2.BAC-FISH的检测结果  42-43
  (二) BAC DNA的修饰结果  43-48
    1.突变盒的克隆和序列分析  43-46
    2.突变BAC的正负筛选  46
    3.Southern杂交检测突变体  46-48
  (三) 显微注射用BAC DNA的制备  48-49
  (四) 转基因鼠系的建立  49-51
    1.转基因鼠的PCR检测  49-51
  (五) α-珠蛋白在转基因鼠中的表达  51-71
    1.α-珠蛋白基因在正常转基因小鼠中表达的检测结果  51-53
    2.转基因鼠体内人α-珠蛋白的检测  53-54
    3.血红蛋白的SDS电泳  54-55
    4.转基因鼠血液中表达蛋白的N-端肽序列和质谱分析  55-68
    5.人α-珠蛋白基因在突变α-BAC M1转基因鼠体内的表达  68-69
    6.人α-珠蛋白基因在突变α-BAC M2转基因鼠体内的表达  69-71
四.讨论  71-79
  (一) 人类基因组序列用于转基因动物的研究  71-72
  (二) 正常191K2转基因鼠的研究  72-74
  (三) HS-40删除后人α-珠蛋白基因在转基因鼠体内的表达  74-75
  (四) HS-4～HS-33间36kb删除对人α-珠蛋白基因表达的影响  75-79
五.小结  79-80
六.参考文献  80-86
七.文献综述  86-92
八.英文名词及缩写  92-94
九.致谢  94-95
十.个人简历  95

细菌人工染色体（BAC）介导的人α-珠蛋白基因簇转基因小鼠的研究

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