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平邑甜茶（M. hupehensis Rehd.）根系钙吸收调节与Ca～（2+）-ATPase特性研究

作　者: 李佳
导　师: 束怀瑞；杨洪强
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 根系钙吸收吲哚丁酸蛋白激酶 Ca2+-ATPase 平邑甜茶
分类号: S661.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本文以当年及二年生平邑甜茶(M. hupehensis Rehd.)为试材,在水培条件下研究了其根系 Ca2+吸收动力学特性、IBA 对其根系 Ca2+吸收和 Ca2+-ATPase 的调节以及Ca2+-ATPase 与平邑甜茶新梢钙含量的相关性,从信号传导角度研究了 IBA 调控钙素吸收的方式,结果如下: 1.根域 Ca2+浓度为 0.04~0.5 mmol/L 时,处理(100 μmol/L 的 IBA)和对照的幼苗根系 Ca2+吸收速率与 Ca2+浓度的关系符合米氏酶动力学模型;而钙浓度为0.5~5mmol/L 时,Ca2+吸收速率与 Ca2+浓度的关系无法用米氏方程拟合。IBA 提高了幼苗根系钙素吸收能力。 2.外源 Ca2+浓度及培养时间影响根系钙素吸收速率、根及叶片中的钙含量。试验过程中,高 Ca2+浓度处理的幼苗,根系 Ca2+吸收速率的增加值与其它处理相比表现为减小,叶片中钙含量增加幅度也减小;无钙处理的幼苗其地上部钙出现向下运送现象。 3.IBA 对根系 Ca2+吸收速率的促进作用与外源 Ca2+浓度及培养时间有关。与对照相比,100 μmol/L IBA 使在低 Ca2+浓度(0.03 mmol/L)营养液中培养 3 天的幼苗根系吸收速率增加 31.7%,培养在中等 Ca2+浓度的营养液中的幼苗根系 Ca2+吸收速率提高约50%,而在 3 mmol/L 的培养条件下,幼苗根系 Ca2+吸收速率仅提高 17.3%。继续在原培养液中培养平邑甜茶幼苗至 12 天,处理和对照的幼苗 Ca2+吸收速率均比处理 3 天时的高。100 μmol/L的IBA使得培养在低Ca2+浓度条件下的幼苗根系吸收速率提高了37.7%;中等浓度和高浓度钙条件下的幼苗根系吸收速率变化值相近,在 80%左右。高浓度的外源钙供应使根系吸收的钙在根部积累,从而影响根系对 Ca2+的继续吸收。中等浓度的Ca2+和生长素共用时根系 Ca2+吸收能力最强。 4.在不含 Ca2+的培养液中培养 3 天的幼苗,IBA 的加入使得根部的钙含量增加(约100μg/gDW),地上部的钙有向下运送的趋势。叶片中钙含量也有增加,但增加量(约48μg/gDW)较小。IBA 处理对培养 12 天的幼苗根和叶片含量的影响不显著。在含有高浓度Ca2+的培养液中培养3天的幼苗,IBA的加入增加了根中的钙含量(约 1<WP=10>平邑甜茶根系钙吸收调节与 Ca2+-ATPase 特性研究增加 140%),叶片中的钙含量增加了 58%。培养 12 天时,叶片和根中的钙含量均比处理 3 天时的对应含量高。与对照相比,IBA 处理使根中钙含量增加,本试验中,根部钙含量为 9.5 mg/gDW 时,根吸收的钙在根中有较多的积累,叶片中钙含量降低,IBA 对植株整体钙素吸收的影响不大。在中等浓度 Ca2+的培养液中培养 3 天的幼苗,IBA 处理与对照的叶片和根中钙含量均表现出显著性差异。IBA 处理的根中钙含量比对照的低,叶片中钙含量比对照的高。培养 12 天时,IBA 处理不影响叶片中钙含量,但影响根中钙含量,使其降低。培养 12天的幼苗叶片和根中的钙含量均比处理 3 天时的对应含量高。低浓度 Ca2+条件下,培养 3 天的幼苗,IBA 处理的幼苗根中钙含量低于对照的根中钙含量,处理的叶片中钙含量高于对照的叶片中钙含量。培养 12 天的幼苗,处理对根和叶片中钙含量的影响同处理 3 天的。IBA 促进了根部钙的向上运送, IBA 对植株钙素营养更有意义。 5.外源 Ca2+浓度和 IBA 均影响根系 Ca2+-ATPase 活性,在 0~3 mmol/L Ca2+浓度范围内,随着Ca2+浓度的升高,根系Ca2+-ATPase 活性增强,长出新根后的根系Ca2+-ATPase活性则进一步增强。IBA 对根系 Ca2+-ATPase 活性有促进作用,而且这一作用在新根长出后更强。 6.平邑甜茶根系的总 Ca2+-ATPase 活性在发根高峰期和非发根高峰期差异不大。发根高峰期的根系内质网和液泡膜 Ca2+-ATPase 活性较质膜为高,非发根高峰期的根系内质网膜 Ca2+-ATPase 活性高于液泡膜和质膜。钙通道抑制剂 Nif 和 Ver 均影响植株的钙含量,进而影响根系 Ca2+-ATPase 活性,但却不能显著影响 IBA 对 Ca2+-ATPase 的激活作用;Ca2+-ATPase 抑制剂 EB 不影响植株的钙含量,可抑制 Ca2+-ATPase 活性。 7.100 μmol/L 的 IBA 使根系蛋白激酶和 Ca2+-ATPase 活性在 2~3 h 内升高数十倍,之后很快下降,蛋白激酶活性变化明显早于 Ca2+-ATPase;蛋白激酶抑制剂 Quercetin 不仅抑制苹果根系膜蛋白的磷酸化,也显著削弱 IBA 对 Ca2+-ATPase 的激活作用。在对 IBA的响应中,Ca2+-ATPase 是信号转导途径中的成员,IBA 通过蛋白磷酸化激活根系Ca2+-ATPase 而起作用。引起苹果根系膜蛋白磷酸化反应的蛋白激酶是丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,磷酸化反应主要发生在丝氨酸残基上。 8.在含 100 μmol/L IBA 的培养液中培养 1、2、2.5、3 小时的平邑甜茶,其根系可溶性蛋白电泳条带不同。处理 2 小时和 2.5 小时的根系可溶性蛋白在 70KD 左右处均有一条带,前者的丰度高于后者,处理 1 小时和 3 小时的根系可溶性蛋白在此处没有带出 2<WP=11>山东农业大学博士学位论文现。4 个处理的其它可溶性蛋白条带出现的位置相同。 9.由根系提取的蛋白质粗提液,在 55%硫酸铵饱和度下沉淀,透析后依次过DEAE-52 柱和 SephacrylS-200 柱,收集并合并能检测到 Ca2+-ATPas

全文目录

中文摘要  9-12
英文摘要  12-16
英文缩略表  16-18
1 前言  18-42
  1.1 概述  18-19
  1.2 植物钙素吸收  19-29
    1.2.1 植物钙素吸收机制  19-21
    1.2.2 细胞原生质膜上的钙转移系统及特性  21-25
    1.2.3 植物体内钙的存在形式  25-26
    1.2.4 果树的钙素吸收及调节  26-29
  1.3 生长素的作用机理  29-31
    1.3.1 生长素的种类及 IAA、IBA 的特性  29-30
    1.3.2 生长素的作用机理  30-31
  1.4 生长素的信号传导  31-37
    1.4.1 生长素的信号传导途径  31-33
    1.4.2 生长素的信号传导组分  33-37
  1.5 植物体内的 Ca~(2+)-ATPase 及其特性  37-40
    1.5.1 植物体内 Ca~(2+)-ATPase 的类型及生理功能  37
    1.5.2 植物体内 Ca~(2+)-ATPase 的活性调节  37-39
    1.5.3 植物体内 Ca~(2+)-ATPase 的基因表达调节  39-40
  1.6 本研究的目的和意义  40-42
2 材料与方法  42-50
  2.1 试验材料  42
    2.1.1 植物材料  42
    2.1.2 主要仪器  42
  2.2 试验设计  42-45
    2.2.1 IBA(根用)和不同浓度 Ca~(2+)对根系钙素吸收的影响  42-43
    2.2.2 钙通道抑制剂和钙泵抑制剂对根系钙素吸收的影响  43
    2.2.3 IBA 对平邑甜茶根系质膜和内膜 Ca~(2+)-ATPase 活性的影响  43
    2.2.4 发根高峰和非发根高峰期的盆栽平邑甜茶根系 Ca~(2+)-ATPase 活性  43-44
    2.2.5 IBA 促进根系钙素吸收的作用方式  44
    2.2.6 IBA(叶用)对一年生平邑甜茶体内贮藏钙的调运  44
    2.2.7 内质网 Ca~(2+)-ATPase 的提取、分离、纯化及其特性研究  44-45
  2.3 试验方法  45-50
    2.3.1 根系表面积及吸收液中 Ca~(2+)含量测定  45
    2.3.2 总钙的测定(湿灰化法)  45
    2.3.3 土壤理化性质分析  45
    2.3.4 膜组分的制备及酶活性测定  45-47
      2.3.4.1 膜组分的制备  45
      2.3.4.2 可溶性组分的制备  45
      2.3.4.3 膜蛋白质浓度的测定  45
      2.3.4.4 H~+-ATPase 活性测定  45-46
      2.3.4.5 Ca~(2+)-ATPase 活性测定  46
      2.3.4.6 膜蛋白中磷酸化氨基酸残基的确定  46-47
      2.3.4.7 膜蛋白激酶活性的测定  47
    2.3.5 质膜、液泡膜、内质网膜的分离及部分纯化  47
      2.3.5.1 质膜、液泡膜的分离及部分纯化  47
      2.3.5.2 内质网膜的粗分离  47
    2.3.6 钙形态分级  47
    2.3.7 Ca~(2+)-ATPase 的粗分离及部分纯化  47-48
      2.3.7.1 粗提取液的制备  47
      2.3.7.2 硫酸铵沉淀  47-48
      2.3.7.3 离子交换层析  48
      2.3.7.4 Sephacryl S-200 分子筛层析  48
      2.3.7.5 蛋白质纯度鉴定  48
    2.3.8 蛋白质分子量的测定  48-50
      2.3.8.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  48-49
      2.3.8.2 蛋白质分子量测定  49-50
3 结果与分析  50-80
  3.1 根域钙浓度对平邑甜茶根系钙吸收的影响  50-53
    3.1.1 根系钙吸收动力学特性  50
    3.1.2 钙浓度对幼苗根系钙吸收速率的影响  50-52
    3.1.3 钙浓度对幼苗根及叶片中钙含量的影响  52-53
  3.2 IBA 对平邑甜茶根系钙素吸收的调节  53-60
    3.2.1 IBA 对幼苗根系钙吸收特征的影响  53-54
    3.2.2 IBA 处理对幼苗根系钙吸收速率的影响  54-55
    3.2.3 IBA 处理对幼苗根及叶片中钙含量的影响  55-58
    3.2.4 IBA 处理和钙浓度对幼苗根系总 Ca2+-ATPase 活性的影响  58-60
      3.2.4.1 不同钙浓度条件下的幼苗根系总 Ca2+-ATPase 活性  58-59
      3.2.4.2 外源 IBA 处理对幼苗根系总 Ca2+-ATPase 活性的影响  59-60
      3.2.4.3 IBA 对平邑甜茶根系质膜和内膜 Ca2+-ATPase 活性的影响  60
  3.3 平邑甜茶根系 Ca~(2+)-ATPase 特性  60-67
    3.3.1 不同发根期的根系 Ca~(2+)-ATPase 活性变化  60-62
    3.3.2 根系 Ca~(2+)-ATPase 提取及部分纯化  62-65
      3.3.2.1 硫酸铵饱和度的选择  62
      3.3.2.2 离子交换层析和分子筛层析  62-65
    3.3.3 根系 Ca~(2+)-ATPase 的特性分析  65-67
      3.3.3.1 pH 值和温度对 Ca~(2+)-ATPase 活性的影响  65
      3.3.3.2 Ca~(2+)-ATPase 的底物特异性  65-66
      3.3.3.3 EB 对 Ca~(2+)-ATPase 活性的影响  66-67
  3.4 IBA 对平邑甜茶根系 Ca~(2+)-ATPase 的调节  67-74
    3.4.1 根系膜蛋白磷酸化  67-71
      3.4.1.1 定量定性分析磷酸化氨基酸  67-69
      3.4.1.2 根系膜蛋白磷酸化的氨基酸残基  69-71
    3.4.2 IBA 影响 Ca~(2+)-ATPase 的作用方式  71-73
      3.4.2.1 IBA 和 Quercetin 对根系膜组蛋白总激酶活性的影响  71
      3.4.2.2 IBA 和 Quercetin 对根系膜组分 Ca~(2+)-ATPase 活性的影响  71
      3.4.2.3 根系膜蛋白总激酶活性和 Ca~(2+)-ATPase 活性变化比较  71-72
      3.4.2.4 蛋白激酶抑制剂对 IBA 作用效果的抑制  72-73
    3.4.3 IBA 处理引起的根系膜可溶性组分的变化  73-74
  3.5 Ca~(2+)-ATPase 与平邑甜茶新梢钙含量的相关性  74-80
    3.5.1 钙通道与 Ca~(2+)-ATPase 抑制剂对植株钙含量的影响  74-76
      3.5.1.1 外源 IBA 和不同抑制剂对根系钙素吸收的影响  74-75
      3.5.1.2 外源 IBA 和不同抑制剂对根系 Ca~(2+)-ATPase 活性的影响  75-76
    3.5.2 IBA 对新梢 Ca~(2+)-ATPase 活性及钙含量的影响  76-77
    3.5.3 IBA 处理对新梢生长量及其相对钙含量的影响  77
    3.5.4 IBA 对新梢中钙存在形态的影响  77-80
4 讨论  80-89
  4.1 平邑甜茶根系钙素吸收受根部钙库的影响  80
  4.2 IBA 促进根系钙素吸收的机制  80-82
  4.3 Ca~(2+)-ATPase 的生理作用  82-84
  4.4 IBA 通过蛋白磷酸化作用激活 Ca~(2+)-ATPase  84-86
  4.5 毛细管电泳技术用于检测磷酸化氨基酸的优势  86-87
  4.6 苹果树体钙素吸收调节的理论与实践意义  87-89
5 结论  89-90
6 参考文献  90-106
7 附录  106-108
8 致谢  108-109
9 攻读学位期间发表论文情况  109

平邑甜茶（M. hupehensis Rehd.）根系钙吸收调节与Ca～（2+）-ATPase特性研究

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