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Alteromonas sp.nov. SY37-12菌株产生的琼胶酶酶学性质及酶解产物的分析

作　者: 王静雪
导　师: 管华诗；江晓路
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工与贮藏
关键词: 交替单胞菌 β-琼胶酶酶解机制产物分析新琼寡糖
分类号: TQ925
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本文以开发海洋活性寡糖为最终目标，以筛选具有优良性状的产琼胶酶菌株以及用酶法降解琼胶获得不同聚合度的寡糖为基本目的和出发点，研究了产酶菌株的生理生化特征，不同因素对菌株发酵产酶的影响和酶的分子量及基本性质，分析了琼胶酶降解琼胶底物产生的寡聚糖产物的结构和组成，对琼胶寡糖的生物活性进行了初步的探讨。（1）从自然界中筛选一株具有优良性状、产琼胶酶能力高的菌株Alteromonas sp. nov. SY37-12，长杆状，0.5～0.6μm×1.8～2.1μm。端生单鞭毛。Alteromonas sp. nov. SY 37-12在2216E培养基上培养24h，菌落圆形，乳白色。菌株在增殖的同时，可使菌落周围的琼胶培养基形成较深的釜底形凹陷，并且具有较大的透明圈，直径约为10mm。该菌株氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，不积累聚羟丁酸盐颗粒作为胞内贮存物，生长不需要有机因子，在没有NaCl存在时菌体不能生长。根据伯杰氏手册第九版确定其为交替单胞菌属的一个新种。通过诱变提高其产酶能力。（2）研究不同因素对产酶的影响以确定最适的发酵培养条件。最适发酵培养基组成：琼胶0.3％，K₂HPO₄ 0.1％，氯化铵0.1％，NaCl 2％，0.05％MgSO₄，0.01％CaCl₂。最适培养条件：250ml三角瓶中装入125ml液体发酵液，最适培养温度、起始pH、转速和培养时间分别为35℃、pH7.0、150rpm在上述条件下发酵培养20h。（3）研究所选菌株产生的胞外琼胶酶的基本酶学性质，琼胶酶分子量并确定最佳的酶反应条件。用饱和度80％的硫酸铵盐析法提取粗酶，用离子交换柱层析和凝胶柱层析将酶纯化了27.6倍，SDS-PAGE测定该菌株产生的琼胶酶的分子量为39.5KDa。确定了最适的酶反应条件：酶反应的最适温度为35℃；酶反应的最适pH值为pH7.0；底物的最适NaCl含量为1％。K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、等离子对酶有促进作用；Fe³⁺、Zn²⁺、Sn²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺等离子对酶有抑制作用。该酶在35℃下具有较好的热稳定性，在50℃以上酶刀tero，on口;sP.nov.sY37一12菌株所产生琼胶酶的酶学性质及酶解产物的分析易失活。该酶对琼胶底物的动力学结果为:Km=6.073，Vmax=0.152 （4）研究琼胶酶降解琼胶的工艺，制备琼胶寡糖。通过基体辅助激光解析离子化飞行质谱确定其分子量和样品的组成。通过’“c一NMR确定琼胶寡糖的类型，确定了该琼胶酶为p一琼胶酶，降解琼胶的p一1，4糖昔键，产生以D一半乳糖为还原性末端，以3，6一内醚一L一半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖系列。（5）分析琼胶降解产物的生物学活性。系列琼胶寡糖具有很好的抗氧化活性。在抗溶血，清除轻基自由基和抑制脂质过氧化方面的活性高于Vc的抗氧化活性。其中样品H7具有一定的抑菌作用，对铜绿假单胞菌和产气杆菌有抑菌作用。最小抑菌浓度分别为10mg/mL和2.5m留mL。本研究为琼胶酶的工业化生产提供了一定的理论基础，为进一步开发海洋活性寡糖具有一定的指导意义。

全文目录

0 绪论  9-33
  0.1 琼胶  11-12
  0.2 琼胶酶的研究进展  12-20
  0.3 琼胶组成与结构的研究方法  20-23
  0.4 琼胶及其降解产物的特殊生理活性  23-33
1 琼胶酶产生菌株的选育和菌种鉴定  33-49
  1.1 引言  33
  1.2 实验材料  33-35
  1.3 实验方法  35-39
  1.4 结果与讨论  39-45
    1.4.1 琼胶酶产生菌株的分离、富集和初筛  39
    1.4.2 复筛和产酶菌株的分离  39-40
    1.4.3 菌种形态观察与鉴定  40-44
    1.4.4 诱变育种  44-45
  1.5 小结  45-49
2 发酵产酶条件优化和培养基优化  49-64
  2.1 引言  49
  2.2 实验材料  49-50
  2.3 实验方法  50-51
  2.4 结果与讨论  51-60
    2.4.1 碳源对产酶的影响  51-53
    2.4.2 氮源对产酶的影响  53-54
    2.4.3 无机盐对产酶的影响  54-55
    2.4.4 不同浓度NaCl对产酶的影响  55-56
    2.4.5 发酵温度对产酶的影响  56-57
    2.4.6 培养基中的起始pH对菌体产酶的影响  57-58
    2.4.7 接种量的确定  58-59
    2.4.8 摇瓶转速对产酶的影响  59
    2.4.9 Alteromonas sp.nov.SY 37-12生长曲线和最佳产酶时间  59-60
  2.5 小结  60-64
3 琼胶酶性质的初步研究  64-83
  3.1 引言  64-65
  3.2 实验材料  65
  3.3 实验方法  65-68
  3.4 结果与讨论  68-78
    3.4.1 酶的盐析  68-66
    3.4.2 琼胶酶的分离与纯化  66-73
    3.4.3 酶的最适反应条件  73-74
    3.4.4 金属离子对酶活的影响  74-75
    3.4.5 酶的耐热性实验结果  75-77
    3.4.6 酶的动力学实验结果分析  77-78
  3.5 小结  78-83
4 琼胶降解产物和酶解机制研究  83-108
  4.1 引言  83-84
  4.2 实验材料  84
  4.3 实验方法  84-88
  4.4 结果与讨论  88-104
    4.4.1 降解产物的乙醇分级  88
    4.4.2 降解产物的红外图谱分析  88-90
    4.4.3 ~(13)C-NMR分析寡糖结构  90-98
    4.4.4 基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱分析降解产物  98-102
    4.4.5 琼胶酶降解机制  102-104
  4.5 小结  104-108
5 琼胶寡糖的生物学活性  108-121
  5.1 引言  108
  5.2 实验材料  108-109
  5.3 实验方法  109-111
  5.4 结果与讨论  111-118
    5.4.1 新琼寡糖的抗氧化活性  111-115
    5.4.2 新琼寡糖的抑菌作用  115-117
    5.4.3 最小抑菌浓度的测定  117-118
  5.5 小结  118-121
论文总结  121-125
后期设想  125-127

Alteromonas sp.nov. SY37-12菌株产生的琼胶酶酶学性质及酶解产物的分析

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