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p33ING1b在细胞衰老过程中的异常表达及其对DNA损伤修复和凋亡的影响

作　者: 肖向茜
导　师: 姚智；毛泽斌
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 年轻细胞 DNA损伤修复衰老细胞细胞衰老异常表达 ING1 启动子活性调控元件荧光素酶表达情况
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

目的：p33ING1b是1996年被发现的，它具有多种生物学功能，在细胞生长的负调控、增殖、衰老、肿瘤的锚着依赖性生长、凋亡及细胞周期调控点的调节等方面发挥作用。本试验的目的是要了解p33ING1b在衰老和年轻细胞中的表达情况，以及它在衰老和年轻细胞中发挥DNA损伤修复和促进凋亡的功能的差异。方法：（1）克隆了p33ING1b 5’端调控区，并构建了荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic-1。在此基础上构建其5’端缺失体，转染人胚肺二倍体成纤维细胞，观察在年轻细胞和衰老细胞中的表达情况。（2）通过RT-PCR分析p33ING1b、p47ING1a和p24ING1c在年轻细胞、衰老细胞、H₂O₂处理的早衰细胞、静止期细胞及肿瘤细胞Lovo和HEPG2中的表达情况。（3）克隆了p33ING1b蛋白质编码序列，并构建了腺病毒表达载体Adeno-33。将Adeno-33与经过紫外线照射的pRL-CMV共转染年轻和衰老HDF细胞，观察对带有海肾荧光素酶报告基因的DNA损伤修复的作用。通过单细胞电泳观察了对细胞内基因组DNA损伤修复的作用。（4）将Adeno-33转入年轻和衰老HDF细胞中，观察对H₂O₂损伤后细胞凋亡的作用。结果:（1）在5’调控区49³36如之间存在一个转录调控元件，使年轻细胞中的p33取Glb启动子活性升高，在1505一1667bP之间存在一个负调控元件，使衰老细胞中的荧光素酶活性增强，在1667bp¹87obP之间存在另一个负调控元件，使336一1870bp之间衰老细胞启动子活性始终比年轻细胞轻度升高。（2）INGI三个异构体在年轻细胞中表达量均高于在衰老细胞中的表达，与5’端缺失体转染分析结果相符。P24顶Glc和p33取Glb在肿瘤细胞中表达均降低，可能与肿瘤的抑制作用相关。（3）外源性转染导致的p33创Glb高表达促进细胞对损伤DNA的修复作用，不论损伤的是转入的外源DNA还是基因组DNA，尤其年轻细胞的作用更显著。（4） p33州Glb使年轻细胞对损伤敏感，玩0:损伤后细胞存活率明显下降，casPase一3活性测定显示与凋亡特异相关的酶活性升高，说明p33INGlb引起的细胞数减少是凋亡相关的。衰老细胞对 p33INGlb反应不敏感，对调亡有抵抗作用。结论:p33INGlb的启动子在年轻细胞中的活性高于衰老细胞，它在年轻细胞中的表达量高于衰老细胞，是由于在调控序列49³36bp之间存在一个转录调控元件。p24INGlc、p33INGlb和好7取Gla在不同的细胞内表达量是有差异的，他们在年轻细胞中的表达均高于衰老细胞。p33mGlb促进衰老和年轻细胞的外源DNA和自身基因组DNA的损伤修复，促进年轻细胞的凋亡。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
英文缩略语表  8-9
综述  9-26
引言  26-28
第一部分人p33ING1b基因5’端调控区的克隆及在衰老过程中的异常表达  28-67
  材料与方法  30-48
  结果  48-64
  讨论  64-67
第二部分 p33ING1b对DNA损伤修复及凋亡的作用  67-94
  材料与方法  69-84
  结果  84-92
  讨论  92-94
小结  94-96
参考文献  96-105
致谢  105

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