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棉纤维优先表达ABC转运蛋白的初步研究

作　者: 朱勇清
导　师: 陈晓亚
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 遗传学
关键词: 棉花棉纤维表皮毛 ABC转运蛋白细胞伸长生长素极性运输维管束
分类号: S562.03
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

棉纤维是棉花种子的表皮毛，它是研究细胞分化、细胞命运决定、细胞伸长、纤维素合成的良好实验系统。我们构建了一个棉纤维早期发育的cDNA文库，从中分离了105个EST。对其中的15个EST分析了它们在发育正常Xu142的胚珠和纤维以及无绒无絮突变体fl的胚珠中表达量的差异，结果发现其中一个EST在野生型胚珠中高表达，而在无毛（无纤维）fl突变体的胚珠中仅有很低水平的表达。该EST相应的基因GhABC1编码一个ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）。进一步的分析表明GhABC1基因在纤维细胞中的表达量很高，在子叶、叶片、茎等组织中低水平表达，在根中则检测不到其转录本。GhABC1仅在纤维发育的伸长期有表达。在同期的纤维伸长受阻的li突变体胚珠和纤维中表达量低。因此GhABC1基因的表达量与纤维细胞的伸长密切相关。Southern杂交显示GhABC1基因在二倍体的亚洲棉基因组中至少含有三个拷贝。GFP和GhABC1的融合基因在洋葱表皮细胞中瞬时表达，荧光信号仅出现在细胞膜上，表明GhABC1可能是一个细胞质膜蛋白。构建了三个由棉纤维特异表达启动子驱动的载体，拟在棉纤维中过量表达或反义抑制GhABC1基因，研究GhABC1蛋白在纤维细胞发育中的功能。另外还构建了由35S驱动的GhABC1的过量表达和显性失活载体，转化拟南芥。在转基因植株后代中出现了有趣的表型。在过量表达GhABC1的转基因拟南芥中，86.7%植株与野生型相同，另外13.3%植株的表型异常，其果荚短小。而在显性失活的转基因植株中表型异常的比例高达34.7%。拟南芥中有一个与GhABC1高度同源的ABC转运蛋白AtWBC11。AtWBC11基因在野生型拟南芥的花和果荚中高表达，在叶片和茎中有较低的表达，而在根中不表达。我们检测了AtWBC11在过量表达GhABC1的转基因拟南芥中的表达量，结果显示AtWBC11在<WP=5>表型正常或异常的转基因植株中的表达水平与野生型相同，因此表型异常与共抑制无关。但GhABC1在表型异常植株的果荚中的表达量比表型正常植株的果荚中的表达量高。显性失活的转基因株系还需进一步的分析。我们从ABRC得到了一个AtWBC11的T-DNA插入突变体：其杂合体表型正常，在其后代中约21%植株的叶片有融合的现象，而且果荚短小，无种子。对AtWBC11的研究将有助于剖析GhABC1的功能。陆地棉(Gossypium hirsutum L.) li突变体种子表皮毛明显偏短，仅具有短纤维。此外，该突变体叶片卷曲，植株扭曲。扫描电子显微镜(SEM)观察发现，li突变体的纤维发育在起始期与正常植株并无明显差异，但在伸长期开始后（如3 Days Post Anthesis, DPA）li突变体的纤维伸长受阻。分析表明li突变体茎中生长素由顶端向基部的极性运输能力下降，仅为正常植株的32%。形态解剖观察发现li突变体茎的形成层和韧皮部分化发育不完全，这与其生长素极性运输能力下降是一致的。生长素的分布模式对植物器官的两侧对称以及维管束的分化等过程起重要的调节作用。本研究显示，棉花li突变体的异常表型，包括纤维细胞伸长的早期终止，可能与其生长素极性运输能力的下降有关，其分子机理有待深入研究。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
文献综述植物ABC转运蛋白的研究进展  10-41
  一引言  10-11
  二 ABC蛋白的结构  11-13
  三 ABC转运蛋白的作用机理  13
  四拟南芥ABC蛋白的分类  13-19
  五植物ABC转运蛋白的功能  19-41
研究论文  41-105
  第一章棉纤维优先表达ABC转运蛋白的初步研究  42-94
    前言  42-49
    结果  49-72
      一棉纤维早期发育cDNA文库的构建及EST的分离  49-50
      二棉纤维优先表达基因的分离  50-52
      三 GhABC1的一级结构分析  52-58
      四 GhABC1的表达特征的分析  58-61
      五 GhABC1基因的诱导表达  61-62
      六 GhABC1在棉花基因组中的Southern分析  62-63
      七 GhABC1的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备的  63-64
      八 GhABC1蛋白的亚细胞定位  64-65
      九棉花转基因  65-66
      十 GhABC1基因的拟南芥转化  66-67
      十一转基因拟南芥的初步分析  67-68
      十二拟南芥AtWBC11的T-DNA插入失活突变体的获得  68-72
    讨论  72-78
    材料与方法  78-88
    参考文献  88-94
  第二章棉纤维发育li突变体生长素极性运输的变化  94-105
    前言  94-95
    材料与方法  95-97
    结果  97-100
      一 li突变体的扫描电镜观察  97-98
      二生长素极性运输的测定  98-99
      三茎的解剖  99-100
    讨论  100-102
    参考文献  102-105
附录一EST的分类和Genbank登录号  105-108
附录二利用抑制差减杂交（SSH）分离纤维发育相关基因  108-113
发表文章  113-114
致谢  114

棉纤维优先表达ABC转运蛋白的初步研究

内容摘要

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