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氨基化明胶的性能及在鼻粘膜给药的应用研究

作　者: 王健
导　师: 毕殿洲；森本一洋
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: 明胶 氨基化明胶 生物粘附 微球 胰岛素 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 鼻粘膜给药 吸收促进剂 干粉剂型
分类号: R94
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


本研究以明胶为原料，在水溶性碳二亚胺存在的条件下与乙二胺反应，首次设计并制备了一种新型带正电荷的生物可降解性聚合物—氨基化明胶。氨基化明胶的数均分子量为97.5kDa，每mg氨基化明胶含伯氨基1.655mol，比明胶具有较好的水溶性和较低的胶凝温度。热分析实验结果表明，氨基化明胶比明胶具有较低的玻璃化温度、较好的分子链柔顺性和链段运动性。 以粘液中发挥粘附作用的主要成分粘蛋白为粘液模型，分别以蒸馏水、人工胃液及人工肠液为介质模型，综合运用比浊法、粘度法、粘附力测定法及表面自由能分析法等方法，分别从胶体学、流变学、力学及热力学的角度，系统地考察氨基化修饰对明胶生物粘附性能的影响。胶体学和流变学的研究结果表明，氨基化明胶与粘蛋白在均相体系中的相互作用比明胶与粘蛋白间的相互作用显著增强，静电引力是相互作用力的主要成分。粘附力测定结果表明，氨基化明胶比明胶具有优越的生物粘附性能，氨基化明胶的快速水化及良好的分子链柔顺性是这一性能的主要原因，热力学研究结果表明，氨基化明胶与粘蛋白在界面处相互作用的自由能显著降低，其降低程度显著大于明胶与粘蛋白相互作用时自由能的降低程度，氨基化明胶溶液能够润湿和铺展于粘蛋白溶液的表面；自由能的色散分量和Lewis酸碱作用分量对这一过程均有重要贡献，但氨基化明胶与明胶之间的差异主要是由界面张力的Lewis酸碱作用分量决定的。各种实验方法得出的结果具有较好的一致性，均表明氨基化明胶与粘蛋白间的相互作用比明胶强，氨基化修饰显著改善了明胶的生物粘附性能。氨基化明胶的生物粘附性能是其正电荷性质、较好的分子链柔性及有利的表面能性质等因素共同决定的。 为进一步考察氨基化明胶的生物粘附性，并为制剂学研究奠定基础，本研究在无外加乳化剂的条件下，将氨基化明胶的水溶液分散在橄榄油中，经乳化、胶凝、脱水及交联等过程，制备了一种新型带正电荷的凝胶微球—氨基化明胶微球。微球平均粒径为40～50μm，大小分布均匀。干燥微球可吸收相当于自身重量约20倍的水形成水凝胶。氨基化明胶微球比明胶微球具有较高的氨基含量，在蒸馏水及磷酸盐缓冲液中均荷正电，在蒸馏水中的Zata电位为41.5mV。随着制备微球时交联剂戊二醛浓度的增大或交联反应时间的延长，微球的氨基含量降低。但无论交联反应的条件如何，本方法制备的氨基化明胶微球比明胶微球具有较高的伯氨基含量。氨基化明胶微球在胰蛋白酶存在的条件下可迅速降解(＜1h)，在胃蛋白酶及酸碱介质环境中降解较为缓慢(＞20h)，在磷酸盐 沈阳药科大学博士学位论文 摘要一缓冲液中具有较好的稳定性。 综合运用多种体内外实验方法研究了氨基化明胶微球的粘膜粘附性能。采用比色法考察了氨基化明胶微球与两种市售粘蛋白在不同介质环境中的相互作用，虽然这种相互作用随介质的种类、pH及离子强度的不同而不同，但是，在相同的试验条件下，吸附到氨基化明胶微球的两种粘蛋白量比吸附到两种明胶微球（IEP＝5刀和 9．0）的粘蛋白量多。这表明，氨基化明胶微球与粘蛋白之间的相互作用比明胶微球强。氨基化明胶微球较高的正电荷密度是它与粘蛋白间较强相互作用的主要原因。 结合荧光标记法及体外酶降解技术，利用离体大鼠胃灌流冲洗模型和大鼠体内实验研究了氨基化明胶微球的生物粘附性能。结果表明，在相同的实验条件下，滞留在离体大鼠胃中的氨基化明胶微球的数量比明胶微球多，而灌流冲洗液的种类（人工胃液或PH 7人磷酸盐缓冲液）对微球的胃滞留性无显著影响，这表明微球与胃粘液之间的静电相互作用不是这一模型中微球胃滞留性的决定性因素。但是，实验中发现滞留在离体大鼠胃中的氨基化明胶微球的量随制备微球时交联剂戊二醛浓度的增大而减少，这表明氨基化明胶微球的胃粘膜粘附性可能受微球表面氨基含量或交联度的影响。大鼠体内实验结果表明，氨基化明胶微球比明胶微球具有较好的粘膜粘附性能。 采用Y闪烁照相技术研究了99”m标记氨基化明胶微球在健康志愿者鼻粘膜的粘附性能。结果表明，氨基化明胶微球比明胶微球具有优越的生物粘附性能。明胶微球和氨基化明胶徽球在健康志愿者鼻腔内的清除半衰期分别为45和87min。氨基化明胶微球较高的氨基含量、氨基化明胶改进的分子链柔顺性和链段运动性、氨基化明胶微球在粘膜表面的吸水溶胀等性质在其生物粘附性方面共同发挥着作用。 鉴于多种阳离子聚合物可以促进水溶性大分子物质从鼻粘膜的吸收，本研究考察了新型带正电荷的聚合物一氨基化明胶用作胰岛素鼻粘膜吸收促进剂的可行性。以健康大鼠为模型动物，考察了氨基化明胶对葡聚糖和胰岛素鼻粘膜吸收的促进作用。结果表明，02％（WN）氨基化明胶可以显著促进分于量为女4kDa的异硫氰酸荧光素－葡聚糖从大鼠鼻粘膜的吸收，生物利用度为23．8％。鼻腔给予含 0二％（w／v）氨基化明胶的胰岛素磷酸盐缓冲液10 IU帅）后，血糖水平与给予胰岛素的磷酸盐缓冲液相比显著降低。这一降糖作用与相同浓度的

全文目录


摘要  12-16
ABSTRACT  16-20
前言  20-32
第一章 氨基化明胶的制备及其性能研究  32-46
  1.1 材料与方法  32-36
    1.1.1 材料和试剂  32
    1.1.2 明胶的精制  32
    1.1.3 氨基化明胶的制备  32-33
    1.1.4 氨基化明胶的红外图谱  33-34
    1.1.5 氨基化明胶分子量的测定  34
    1.1.6 氨基化明胶的水溶性及胶凝性能  34
    1.1.7 氨基化明胶的玻璃化温度测定  34
    1.1.8 氨基化明胶粘度的测定  34
    1.1.9 氨基化明胶等电点的测定  34
    1.1.10 氨基化明胶中伯氨基含量的测定  34-36
      1.1.10.1 原理及方法  34-35
      1.1.10.2 标准曲线的制作  35-36
      1.1.10.3 氨基化明胶中的伯氨基含量测定  36
  1.2 结果与讨论  36-45
    1.2.1 氨基化明胶的制备  36-38
    1.2.2 氨基化明胶的水溶性及胶凝性能  38-39
    1.2.3 氨基化明胶的粘度  39-41
    1.2.4 氨基化明胶的等电点  41-42
    1.2.5 氨基化明胶的玻璃化温度  42-43
    1.2.6 氨基化明胶的伯氨基含量  43
    1.2.7 氨基化明胶的分子链柔性  43-44
    1.2.8 氨基化明胶的生物粘附性化学结构基础  44-45
  1.3 小结  45-46
第二章 氨基化明胶的生物粘附性能及粘附机理研究  46-74
  2.1 材料和方法  46-54
    2.1.1 材料和试剂  46-47
    2.1.2 胶体学研究  47
    2.1.3 流变学研究  47-48
    2.1.4 力学研究  48-49
    2.1.5 热力学研究  49-54
      2.1.5.1 理论基础  49-54
      2.1.5.2 表面张力的测定  54
      2.1.5.3 接触角的测定  54
      2.1.5.4 表面自由能参数的计算  54
  2.2 结果与讨论  54-72
    2.2.1 胶体学研究  55-58
    2.2.2 流变学研究  58-59
    2.2.3 粘附力学研究  59-60
    2.2.4 热力学研究  60-66
      2.2.4.1 氨基化明胶的表面张力  61-62
      2.2.4.2 氨基化明胶在PTFE和PMMA表面的接触角  62-63
      2.2.4.3 液体在氨基化明胶薄膜表面的接触角  63
      2.2.4.4 表面张力及表面自由能参数  63-66
    2.2.5 聚合物生物粘附性体外实验方法及其一致性  66-70
    2.2.6 氨基化明胶的生物粘附机理探讨  70-72
      2.2.6.1 电荷作用机制  70-71
      2.2.6.2 扩散／渗透作用机制  71
      2.2.6.3 表面自由能作用机制  71-72
  2.3 小结  72-74
第三章 氨基化明胶微球的制备及其性能研究  74-86
  3.1 材料与方法  74-77
    3.1.1 材料和试剂  74
    3.1.2 微球的制备  74-75
      3.1.2.1 微球的制备工艺考察  74-75
      3.1.2.2 氨基化明胶微球的制备  75
      3.1.2.3 明胶微球的制备  75
    3.1.3 微球粒子大小的测定  75-76
    3.1.4 微球外观形态观察  76
    3.1.5 微球zata电位的测定  76
    3.1.6 微球溶胀性能考察  76
    3.1.7 微球中伯氨基含量的测定  76-77
    3.1.8 微球体外降解性能考察  77
  3.2 结果与讨论  77-84
    3.2.1 微球的制备工艺  77-79
      3.2.1.1 氨基化明胶浓度的选择  78
      3.2.1.2 水油两相配比的选择  78
      3.2.1.3 搅拌速度的选择  78
      3.2.1.4 乳化时间的选择  78
      3.2.1.5 交联介质及交联反应时间的选择  78-79
    3.2.2 微球的粒径分布  79-80
    3.2.3 微球的外观形态  80-81
    3.2.4 微球的表面电荷  81
    3.2.5 微球的溶胀性能  81-82
    3.2.6 微球的伯氨基含量  82-83
    3.2.7 微球的体外降解性能  83-84
  3.3 小结  84-86
第四章 氨基化明胶微球的生物粘附性能及粘附机理研究  86-112
  4.1 材料和方法  86-92
    4.1.1 试剂和实验动物  86-87
    4.1.2 微球的制备  87
    4.1.3 微球与粘蛋白之间的相互作用研究  87-88
      4.1.3.1 分析方法的建立  87-88
        4.1.3.1.1 试剂的制备  87
        4.1.3.1.2 标准曲线的制作  87-88
      4.1.3.2 微球与粘蛋白之间相互作用考察  88
    4.1.4 微球生物粘附性能体外研究  88-90
      4.1.4.1 荧光标记微球分析方法的建立  88-90
        4.1.4.1.1 若丹明B异硫氰酸盐在不同介质中的稳定性考察  88-89
        4.1.4.1.2 微球的荧光标记  89
        4.1.4.1.3 标准曲线的制作  89-90
      4.1.4.2 大鼠胃的分离及冲洗  90
      4.1.4.3 微球在离体大鼠胃粘膜的滞留性考察  90
    4.1.5 微球生物粘附性能体内考察  90-92
      4.1.5.1 微球体内胃粘膜粘附性能  90-91
      4.1.5.2 微球鼻粘膜粘附性能  91-92
        4.1.5.2.1 受试者的选择  91
        4.1.5.2.2 微球的放射标记  91
        4.1.5.2.3 鼻腔给药实验设计  91
        4.1.5.2.4 鼻腔给药及γ闪烁观测  91-92
  4.2 结果与讨论  92-110
    4.2.1 微球的性质  92
    4.2.2 评价微球生物粘附性能的实验方法选择  92-93
    4.2.3 微球与粘蛋白之间的相互作用  93-101
      4.2.3.1 微球与粘蛋白在几种常用介质中的相互作用  93-96
      4.2.3.2 介质pH对微球与粘蛋白间相互作用的影响  96-98
      4.2.3.3 介质离子强度对微球与粘蛋白间相互作用的影响  98-99
      4.2.3.4 温度对微球与粘蛋白间相互作用的影响  99-101
    4.2.4 微球体外生物粘附性能  101-105
      4.2.4.1 RITC的荧光稳定性  101
      4.2.4.2 微球荧光标记的效率  101-102
      4.2.4.3 微球在离体灌流冲洗大鼠胃中的滞留性  102-105
    4.2.5 微球胃粘膜粘附性能  105-106
    4.2.6 微球鼻粘膜粘附性能  106-108
    4.2.7 氨基化明胶微球的生物粘附机理探讨  108-110
      4.2.7.1 电荷作用机制  108-109
      4.2.7.2 扩散渗透机制  109
      4.2.7.3 吸水溶胀机制  109-110
  4.3 小结  110-112
第五章 氨基化明胶对胰岛素鼻粘膜吸收的促进作用及作用机理研究  112-132
  5.1 材料和方法  112-119
    5.1.1 试药和动物  112
    5.1.2 鼻粘膜给药溶液制剂的制备  112-113
      5.1.2.1 异硫氰酸荧光素-葡聚糖溶液的制备  112
      5.1.2.2 胰岛素制剂的制备  112-113
    5.1.3 异硫氰酸荧光素-葡聚糖鼻粘膜给药及血样分析  113-114
      5.1.3.1 大鼠手术处理  113-114
      5.1.3.2 鼻腔给药  114
      5.1.3.3 血样采集及预处理  114
      5.1.3.4 血浆异硫氰酸荧光素-葡聚糖浓度测定  114
    5.1.4 胰岛素制剂鼻腔给药及血糖测定  114-116
      5.1.4.1 大鼠手术处理  114
      5.1.4.2 鼻腔给药  114-115
      5.1.4.3 血样采集及预处理  115
      5.1.4.4 标准曲线的制备  115-116
      5.1.4.5 血糖浓度测定  116
    5.1.5 异硫氰酸荧光素-葡聚糖从鼻粘膜流出的测定  116-117
      5.1.5.1 大鼠手术处理  116
      5.1.5.2 异硫氰酸荧光素-葡聚糖静脉给药及鼻腔灌流  116-117
      5.1.5.3 鼻腔灌流液中异硫氰酸荧光素-葡聚糖的测定  117
    5.1.6 氨基化明胶对鼻粘膜毒性的研究  117-118
      5.1.6.1 大鼠手术处理  117
      5.1.6.2 鼻腔灌流及样品采集  117
      5.1.6.3 LDH活性测定  117-118
    5.1.7 数据处理及统计分析  118-119
      5.1.7.1 异硫氰酸荧光素-葡聚糖自鼻粘膜的吸收  118
      5.1.7.2 胰岛素自鼻粘膜的吸收  118-119
  5.2 结果与讨论  119-131
    5.2.1 氨基化明胶对异硫氰酸荧光素-葡聚糖鼻粘膜吸收的促进作用  119-120
    5.2.2 氨基化明胶对胰岛素鼻粘膜吸收的促进作用  120-122
    5.2.3 氨基化明胶的浓度对胰岛素鼻粘膜吸收促进作用的影响  122-123
    5.2.4 pH对氨基化明胶的胰岛素鼻粘膜吸收促进作用的影响  123-125
    5.2.5 异硫氰酸荧光素-葡聚糖自鼻粘膜的流出  125-126
    5.2.6 氨基化明胶对乳酸脱氢酶自鼻粘膜释放的影响  126-128
    5.2.7 氨基化明胶对鼻粘膜吸收促进作用的机理  128-131
  5.3 小结  131-132
第六章 氨基化明胶微球作为胰岛素鼻粘膜给药载体的初步研究  132-148
  6.1 材料和方法  132-138
    6.1.1 试剂和动物  132
    6.1.2 空白微球的制备  132-133
    6.1.3 胰岛素的荧光标记  133
    6.1.4 RISC标记胰岛素的荧光稳定性考察  133
    6.1.5 微球体外释药性能考察  133-135
      6.1.5.1 标准曲线的建立  133-134
      6.1.5.2 微球的载药  134
      6.1.5.3 微球体外释药性能考察  134-135
    6.1.6 胰岛素微球干粉鼻腔给药及其降糖作用考察  135-137
      6.1.6.1 载药微球的制备  135
      6.1.6.2 大鼠手术处理  135
      6.1.6.3 微球干粉鼻腔给药  135-136
      6.1.6.4 血样采集及预处理  136
      6.1.6.5 血糖浓度测定  136
      6.1.6.6 数据处理  136-137
    6.1.7 胰岛素微球混悬剂鼻腔给药及其降糖作用考察  137
      6.1.7.1 载药微球的制备  137
      6.1.7.2 微球混悬剂鼻腔给药及血糖测定  137
    6.1.8 统计分析  137-138
  6.2 结果与讨论  138-147
    6.2.1 载药微球的制备  138-139
    6.2.2 微球体外释药性能  139-142
      6.2.2.1 RITC标记胰岛素的荧光稳定性  139
      6.2.2.2 体外释药实验中胰岛素的分析  139-140
      6.2.2.3 微球体外释药性能  140-142
    6.2.3 胰岛素微球干粉给药后的降糖作用  142-144
    6.2.4 胰岛素微球混悬剂给药的降糖作用  144-147
  6.3 小结  147-148
全文总结  148-152
参考文献  152-161
致谢  161-162
发表论文  162

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