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小鼠黑素瘤特异性T淋巴细胞的体外诱导及抗瘤活性的实验研究

作　者: 田蓉
导　师: 刘玉峰
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 黑素瘤 T淋巴细胞过继性治疗基因免疫治疗金黄色葡萄球菌肠毒素SEA 树突状细胞DC
分类号: R73-36
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

过继免疫治疗，即给患者输注抗肿瘤免疫效应细胞的方法，是治疗恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)的一种重要的免疫策略。研究证实，MM对LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)、TIL细胞(肿瘤浸润淋巴细胞)、CD3AK(抗CD3单抗激活的杀伤细胞)、PAK(PHA激活的杀伤细胞)、NK细胞等免疫细胞疗法均有一定的反应性。但由于激活效应细胞方法、种类单一；特异性和活性不高、持续作用时间短暂，因此整体疗效不尽人意。最新研究表明，经肿瘤疫苗刺激后的肿瘤过滤淋巴结(tumor-draining lymph node，TDLN)来源的T细胞，用CD3+CD28+IL-2体外刺激后重新置入体内，具有更强的抗肿瘤作用。美国密西根大学的研究小组应用TDLN细胞联合CD3+CD28+IL-2体外刺激方案，治疗晚期黑素瘤和肾癌，动物与临床实验均取得了明显疗效。超抗原SEA(staphylococcal enterotoxin A)是金黄色葡萄球菌肠毒素，它能以完整的蛋白质分子形式分别直接与APC膜上MHCⅡ类分子抗原结合槽外侧及T细胞表面抗原识别受体TCRV β区相结合，不需要抗原提呈细胞第四军医大学博士学位论文（APC）处理，即可激活比普通抗原多达数千乃至数万倍的T淋巴细胞，是一种强大的 T细胞激活剂。树突状细胞 DCUendritic cell）作为体内最重要的抗原提呈细胞，由于细胞表面高表达T细胞活化所需的多种免疫分子，能够有效递呈抗原和高效激活T细胞。鉴于SEA和DC在活化T细胞及抗肿瘤免疫方面的独特作用，我们用 SEA基因修饰的 BI6细胞免疫的小鼠淋巴结 T 细胞（p LN人在CD3＋CD28＋IL上方案基础上增加经B16细胞裂解物冲击的DC细胞，体外联合刺激，以期寻找更加优化的诱导特异、高效杀伤MM 肿瘤细胞的方案，探索更加有效的治疗黑素瘤的免疫治疗途径。我们构建了 pCDNA3．lSEA真核表达载体，应用脂质体介导转染 BI6 ’J’ 鼠黑素瘤细胞，G4加压筛选，得到阳性克隆后扩大培养，经 RT．PCR鉴定转染成功。将BALB／c小鼠分成实验组和对照组，分别经小鼠尾静脉注射转染与未转染的B16细胞，两周后观察小鼠肿瘤肺转移灶的个数，结果显示：与对照组相比，S趴实验组小鼠肺部转移灶明显减少，差异显著中刃．01），证明 SEA能够提高 BI6细胞的免疫原性，有效激发小鼠体内针对 BI6细胞 T细胞的杀伤活性及抗黑素瘤的免疫反应。本实验予高剂量Q00mg／kg体重）环磷酚胺（CY）经尾静脉注射小鼠，8天后可见小鼠脾脏显著增大，此脾细胞经 GM（SFQ）＋n斗（lug／u）培养，第5天补加细胞因子M Y＊＊吕天后，获得大量淋巴系 DC细胞，即 CYSPDC，每只小鼠平均可得 7．5 X”细胞。培养后的细胞经相差显微镜、扫描电镜及透射电镜观察，均具有典型的DC形态特征。同时，应用流式细胞仪分析细胞的表型，结果显示 N418（CD 11。）MHCll （lab）；MHC－1类（H ZDb＼B7上比D86）等成熟DC细胞表面的主要免疫标记分子随时间变化总体呈现上升趋势，到第7天时，B7．2（CD86）高达到 80．59％。以上证实我们已在体外培养出具有免疫活性的成熟的DC细胞。我们用 SEA基因修饰的与未经任何修饰的 BI6细胞分别免疫 BALB／c小 ·4· 第四军医大学博士学位论文鼠的两侧腹股沟淋巴结；以 BI6细胞抗原裂解物冲击体外培养的成熟 DC；第 9天取出淋巴结细胞，以DC＋rln－2＋mCD3＋ffiCD28及mCD3＋mCD28＋rIL－2为刺激条件培养，3天后进行体外相关免疫学功能检测。实验结果显示，经SEA 免疫和 DC＋CD3＋CD28＋n－2联合诱导的 T细胞MTh增殖指数为 63％士 0．03；h．T妞杀伤活性为87．6％、sl．30、76．5O（效靶比40：120：110： 1）；流式细胞仪检测的CD4、CDS、IN’F．Y表型为60。01％、38．46％、 88．70％，均高于其它实验组中刃．01人而IL10最低，5．叮％；另外，在B16 细胞免疫，联合DC＋rILZ＋mCD3＋mCD28刺激的T细胞实验组也显示了仅次于上组但明显高于别组的体外增殖和杀伤活性。建立黑素瘤小鼠肺转移模型，将体外刺激的T细胞经尾静脉回输小鼠体内，观察对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用，实验结果显示：经SEA免疫和DC＋rIL．2＋mCD3＋mCD28联合诱导的T细胞抑瘤率为87．2％，明显高于其它实验组，具有较强的体内杀伤肿瘤细胞的活性。我们的上述研究表明，经 BI6－SEA肿瘤疫苗刺激后的 TDLN来源的 T 细胞，体外经DC＋CD3＋CD28＋IL．2方案刺激，可以诱导出较单纯CD3＋CD28 ＋o．2刺激更高效、特异的针对黑素瘤的T淋巴细胞，在体内外具有较强的抑制和杀伤肿瘤细胞的能力。这种诱导T细胞?

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
前言  14-15
第一部分 SEA真核表达载体的构建、表达及致瘤作用研究  15-35
  材料与方法  15-27
  结果  27-32
  讨论  32-35
第二部分小鼠DC细胞的体外培养及鉴定  35-48
  材料与方法  35-40
  结果  40-44
  讨论  44-48
第三部分小鼠特异性T淋巴细胞的体外诱导及体内外实验研究  48-65
  材料与方法  48-53
  结果  53-62
  讨论  62-65
小结  65-66
文献回顾  66-91
  超抗原SEA抗肿瘤研究进展  66-74
  树突状细胞与抗肿瘤免疫进展  74-82
  黑素瘤免疫治疗的研究概况  82-91
致谢  91-92
博士期间撰写及发表文章  92-93
参考文献  93-103

小鼠黑素瘤特异性T淋巴细胞的体外诱导及抗瘤活性的实验研究

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