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Smads信号分子在成牙本质细胞分化中作用的研究

作　者: 何文喜
导　师: 牛忠英
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: Smad 转化生长因子β1 信号转导 MDPC-23 成牙本质细胞分化转录调控
分类号: R780.2
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

转化生长因子β1(Tansforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种多功能的生长因子，参与调控细胞许多生理活动，包括细胞增殖、分化、凋亡、基质分泌和免疫反应。TGF-β1通过细胞膜表面Ⅰ、Ⅱ型丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶受体发挥其生物学效应，TGF-β1结合到细胞膜表面引起Ⅰ型受体被Ⅱ型受体活化，活化后的Ⅰ型受体作用于下游的途径限制性Smads，Smad2或Smad3，使其磷酸化。磷酸化后的Smad2或Smad3与一种共同中介型Smad，Smad4，形成异源寡聚物，转位至细胞核内。在细胞核内，Smad2／4或Smad3／4异源寡聚物，或者通过结合DNA结合蛋白，或者通过直接结合基因启动子上DNA序列，调控目的基因的转录。Smad7属于抑制性Smads，它可能通过竞争结合Ⅰ型受体或Smad4，从而抑制TGF-β1信号转导。研究表明TGF-β1参与调控成牙本质细胞分化和牙本质形成。前成牙本质细胞和成牙本质细胞均表达TGF-β1 mRNA，分化成熟的成牙本质细胞表达并分泌TGF-β1沉积在牙本质基质中，当牙髓损伤时，牙本质内的TGF-β1可以被释放出并参与第三期牙本质形成。研究认为TGF-β1是牙本质基质中的活性成分，参与调控细胞生长、分化和基质合成。研究牙本质形成和牙釉质形成时TGF-β1作用时发现，在牙发生早期，TGF-β1 mRNA表达量较低，当基质开始形成时，TGF-β1 mRNA表达量上调。体外培养牙乳头器官发现TGF-β1影响成牙本质细胞分化。基因敲除TGF-β1发现TGF-β1(-/-)小鼠磨牙咬合面出现牙釉第四军医大学博士学位论文质和牙本质明显的磨损。TGF仔过表达的转基因小鼠发现 TGF6调控牙本质涎磷蛋白（DSPP）的表达，而后者在正常牙齿矿化过程中发挥关键的调控作用。尽管有关 TGF乃的研究取得如此多的进展，但是目前尚未阐明 TGF乃在成牙本质细胞分化和细胞外基质生物合成中作用的分子机制。本课题研究的目的是观察 Smads信号分子在 TGF印调控成牙本质细胞分化和细胞外基质蛋白合成中的作用，探讨 TGF6在成牙本质细胞分化和细胞外基质合成中的作用机制。本研究包含三个部分：第一部分Smads在MDPC毛3细胞中的表达、调控及其在TGF个1信号途径中作用的研究在这个部分，首先对从 Dr．Jacques E．Nor获得的成牙本质细胞样细胞系 MDPC－23的生物学特征进行了研究。结果表明MDPC－23保持了其原有的特性，主要包括1）上皮样细胞形态，有多个细胞膜突起；2）易形成细胞结节，细胞倍增时间少于 24h；3）表达 1型胶原、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、骨桥素（OPN）和牙本质涎磷蛋白（DSPP）。其次，对Smads分子在MDPC工3细胞内的表达、调控及其功能进行了研究。半定量RT－PCR方法发现SmadZ、3、7均在MDPC－23细胞内表达石madZ mRNA 表达不受 TGF卡刺激的影响，Smad3 mRNA表达在 TGF仔刺激 4h后开始下调，Smad7 mMA的表达则受 TGF6快速诱导而上调，在 90 ruin达到最高峰，以后逐渐下降。免疫组化法发现SmadZ和 Smad3在TGF乃刺激 lh后从胞浆向胞核转位，而Smad7在细胞浆的表达虽然明显增加，但细胞内定位未见任何变化。通过共转染一个TGF6反应性报告基因载体，p3TPLux，研究Smad 在 TGFf 诱导的转录调控中的功能。结果表明 Smad3，而不是 SmadZ，增强 TGF仔l诱导的转录调控，Smad7则抑制TGF乃l诱导的转录调控。第二部分Smads在TGF个1调控MDPC－23细胞分化中作用的研究在这个部分，为了观察Smads分于在MDPC上3 细胞中的作用。用 LipofectAMINE法分别将SmadZ、Smad3及它们的突变体稳定转染至MDPC上3 细胞内，用 300卜g／Inl G418筛选 2周后得到阳性克隆。阳性克隆用 amFlag单 D幼artment Of枷eranve Dent。叩。＂dEn砌加ti。5 第四军医大学博士学位论文克隆抗体通过Western免疫印迹杂交进一步鉴定。利用这些稳定转染Smads的细胞系，首先观察Smads是否参与TGF扒对MDPC23的生长抑制作用。MH法和 FCM发现 TGF乃显著抑制 MDPC上3细胞增殖。过表达SmadZ或SmadZAC均中度抑制MDPC－23细胞生长，但SmadZAC的作用较SmadZ弱。增强Smad3表达产生比SmadZ过表达更强的生长抑制效果，但是 Smad3D对细胞增殖无明显影响。在 10ng／ml TGF个作用下，SmadZ或Smad3过表达都明显增强TGF仔l的生长抑制效果，但是Smad3的效果较SmadZ强。TGFpl存在时，表达SmadZAC或Smad3D均显著抑制了TGF乃l的生长抑制作用，只不过SmadZAC 的作用较Smad3D弱。这些结果表明MDPC－23细胞内 SmadZ和 Sma3都是 TGFf 生长抑制作用的信号分子，但是Smad3比SmadZ更有效。接着，研究了 Smads是否参与 TGF刊对牙本质细胞外基质蛋白的调控。结果表明TGF－pl抑制OC和DSPP的表达，但是却增强COLIAZ和O地的表达。无论是否存在TGF＊刺激，SmadZ和SmadZAC 对COLIAZ、OPN和DSPP的表达无明显影响。SmadZ过表达造成OC表达

全文目录

缩略语表  6-9
中文摘要  9-14
英文摘要  14-19
前言  19-20
文献回顾  20-55
  一 TGF-β／Smads信号途径研究进展  20-38
  二荧光素酶报告基因系统的应用及其意义  38-55
研究内容  55-140
  第一部分 Smads在MDPC-23细胞中的表达、调控及其在TGF-β1信号途径中作用的研究  55-82
    实验一 MDPC-23细胞系的生物学特征  55-65
    实验二 Smads在MDPC-23细胞中的表达、调控以及在TGF-β1诱导的转录活性中的作用  65-82
  第二部分 Smads在TGF-β1调控MDPC-23细胞分化中作用的研究  82-111
    实验一稳定表达Smads的MDPC-23细胞模型的建立和鉴定  82-90
    实验二 Smads在TGF-β1调控MDPC-23细胞增殖中的作用  90-98
    实验三 Smads在TGF-β1调控牙本质基质蛋白表达中的作用  98-111
  第三部分 Smads在TGF-β1调控DSPP基因转录中的作用  111-140
    实验一 MDPC-23细胞内DSPP基因启动子的克隆与序列分析  111-125
    实验二 Smads在TGF-β1调控DSPP基因转录中的作用  125-131
    实验三转录因子AP-1或Cbfa1在Smad3调控DSPP基因转录中的作用  131-140
全文总结  140-142
致谢  142-144
简历  144-145

Smads信号分子在成牙本质细胞分化中作用的研究

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