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辅酶NADH对化疗药物介导凋亡损伤的细胞保护机制

作　者: 徐萌
导　师: 张积仁
学　校: 第一军医大学
专　业: 内科学（消化系病）
关键词: 辅酶 NADH 化疗凋亡细胞保护顺铂阿霉素毒性线粒体跨膜电位活性氧分子细胞色素C 聚腺苷二磷酸核苷聚合酶逆转录聚合酶链反应氧化磷酸化
分类号: R73-36
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

背景化疗在恶性肿瘤综合治疗中发挥重要的作用，对于皮肤癌、绒毛膜上皮癌和视网膜母细胞瘤等恶性肿瘤，化疗已经取得良好的临床治愈疗效。但是，化疗严重的毒副反应，如骨髓抑制、粘膜炎、肾毒性、神经毒性和心脏毒性，限制化疗药物的疗效。肿瘤化疗实际上是达到最大肿瘤组织杀伤和最小正常组织损伤之间的平衡。如果要进一步提高抗肿瘤药物的有效率，必须保护正常组织免受此类细胞毒药物的速发和迟发性毒副反应。作为肿瘤化疗的细胞保护剂，能够降低化疗毒副反应和提高疗效。还原型辅酶 NADH参与细胞线粒体能量生成和细胞代谢，在三磷酸腺苷产生过程发挥关键作用。NADH参与损伤细胞的修复，它是自然界强效生物抗氧化剂，能够抑制自由基引起的细胞损伤。NADH能够增加大脑某些神经递质的分泌，改善帕金森氏综合征运动障碍和部分感知功能低下疾病症状。凋亡参与许多生理和病理过程，多种抗肿瘤药物通过凋亡途径杀伤细胞，化疗药物引起的细胞毒性损伤往往与细胞线粒体有关，线粒体是细胞凋亡过程重要的执行者，抗凋亡剂能起线粒体膜稳定作用。凋亡分子Caspases在凋亡过程中活化，某些Caspases抑制剂抑制凋亡产生。通过调节凋亡的发生和发展将为减轻化疗所致凋亡损伤提供新的思路和方法。目的本研究通过观察体外化疗药物介导正常细胞凋亡损伤，探讨辅酶NADH抗凋亡效应，NADH细胞保护的线粒体调控机制和预防阿霉素心脏毒性的机制，旨在阐明辅酶NADH在化疗药物介导凋亡损伤中细胞保护的分子机制，为发展新型化疗细胞保护剂，开辟辅酶NADH应用新领域，·早日解决肿瘤化疗领域的难题－如何尽量减轻和避免化疗对正常组织细胞毒副反应，提供新的策略。方法／乙采用＊＊T比色法检狈＊＊P对人u2肝细胞的细胞毒性作用，＊＊＊。对细胞增殖活性的影响，NADH对DDP细胞毒作用的影响；流式细胞仪检测观察细胞凋亡率变化；T删EL染色荧光显微镜检测细胞凋亡改变：透射电镜和扫描电镜观察NADH抑制DDP诱导凋亡的超微结构变化；研究辅酶NADH对DDP介导肝细胞凋亡的抑制效应。2．采用激光扫描共聚焦显微镜通过荧光探针R123检测线粒体跨膜电位凸 Win，探针 Flu－3叭M测定胞浆游离比“，探针 SNARF小AM 检测细胞胞浆pH值和荧光探针HZDCF测定胞浆ROS水平变化；通过比色法坝定Caspase－3活性和 Caspase－8活性改变；RT－PCR检测Fas、P53、Bcl－2和p·actin基因mRNA表达；Western blot检测 CytO C和 PARP蛋白表达变化；研究顺铂诱导 L02细胞凋亡损伤和辅酶NADH细胞保护干预，阐明辅酶NADH细胞保护的线粒体调控机制。3．采用乳鼠心肌细胞原代培养，流式细胞仪观察心肌细胞凋亡率变化，激光扫描共聚焦显微镜检测胞浆游离 CaZ”和ROS 7K平改变；健康SD大鼠随机分4组，ADR处理组、NADH／ADR处理组、NADH 处理组和对照组，检测大鼠心功能和心电图改变，分析左心室收缩峰压（LVSP）和左心室内压变化的最大上升和下降速度（土dp用二：Xh 透射电镜检测心肌超微结构改变：心肌线粒体氧化磷酸化功能检测计算状态3氧耗率侣3）状态4氧耗率侣小呼吸控制比阻CR）和磷／氧比（ADP／OX RTPCR检测 SD大鼠心肌组织 AdRK 6、AT；R。和p－＊chn基因m RNRNA表达：裸鼠鼻咽癌瘤模型的建立和治疗干预实验，裸鼠随机分为对照组、ADR组和 NADH／ADR组，精密卡尺测量瘤体的大小，所有裸鼠均取瘤体、心脏作病理检查；荧光分光光度计测定心肌细胞胞浆ADR的荧光值，在荧光显微镜下观察ADR 在细胞内的分布；紫外分光光度计测定组织细胞胞浆NADH浓度；研－4－究辅酶NADH预防阿霉素心脏毒性的机制。结果1．体外化疗药物凋亡损伤和辅酶NADH抗凋亡效应1＊不同浓度化疗药物DDP和辅酶NADH对肝细胞生长的影响 DDP诱导的正常人肝L02细胞变圆，贴壁能力逐渐消失，细胞体积变小，细胞核浓缩，生长抑制，0．2 u m DDP培养 24h即开始出现生长抑制，至 3 urn DDP培养 72h细胞几乎完全不能生长，说明随着DDP浓度增加和培养时间延长，DDP对肝细胞杀伤抑制作用增强；0．lmM至 1．6mM浓度 NADH处理的细胞生长未受抑制，同一时间段内，各浓度NADH组与对照组比较，细胞生长率无显著差异，说明 0．lmM至 l．6mM NADH对肝细胞生长无明显影响。l二辅酶NADH抑制DDP的细胞毒性作用＊＊＊H／D＊P组生长率显著高于＊＊P组沪＜0刀5X 第12h、24h、 36h和 48h生长率由 83土30、78土30、68士6o和 47士5o上升到 99土4D、118土6O、131士60和 134o士60，而DDP／NADH组生长率与DDP组比较无显著性差异，提示NADH能够预防DDP对肝细胞的细胞毒性损伤。1．3辅酶NADH抑制DDP介导的凋亡损伤 DDP组第 12h至第48h凋亡率分

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缩略词表  3-5
中文摘要  5-11
英文摘要  11-19
前言  19-23
第一部分体外化疗药物凋亡损伤和辅酶 NADH抗凋亡效应  23-40
  材料和方法  23-28
  结果  28-37
  讨论  37-40
第二部分辅酶NADH细胞保护的线粒体调控机制  40-59
  材料和方法  40-47
  结果  47-54
  讨论  54-59
第三部分辅酶NADH预防阿霉素心脏毒性的机制  59-87
  材料和方法  59-67
  结果  67-83
  讨论  83-87
研究结论  87-88
参考文献  88-95
致谢  95-96
附录一博士期间主要工作  96-98
综述  98-122
  辅酶NADH应用的研究进展  98-106
  细胞凋亡和线粒体调控通路  106-115
  阿霉素心脏毒性的发生和防护  115-122

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