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主动脉瓣退行性钙化机制及调控的实验研究

作　者: 陈思
导　师: 董念国
学　校: 华中科技大学
专　业: 心血管外科学
关键词: 主动脉瓣 间质细胞 内皮细胞 胶原酶 细胞培养 钙化 表型 主动脉瓣钙化 共培养 调控钙化 瓣膜退行性钙化 核心结合因子Cbfa1 骨钙素 间质细胞表型转化
分类号: R543
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的体外分离和培养瓣膜间质细胞和内皮细胞,总结一种方便、快捷、重复性高的瓣膜细胞分离培养方法。方法采用胶原酶消化法从猪主动脉瓣中分离并体外扩增瓣膜间质细胞和内皮细胞。光学相差显微镜每日观察细胞形态。生长良好的2-3代细胞传入培养板,每日计算细胞个数绘制生长曲线。免疫荧光染色行细胞表型鉴定,激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。结果胶原酶消化法可成功从猪主动脉瓣中分离出间质细胞和内皮细胞,1-2周即可获得排列紧密的细胞单层。间质细胞生长排列呈放射状或漩涡状走行,并可互相重叠生长。内皮细胞紧密排列似典型鹅卵石或铺路石样分布。细胞生长曲线示间质细胞生长活跃期为传代后3-5天,内皮细胞为第4-5天。表型鉴定提示瓣膜间质细胞α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(vimentin)免疫荧光染色阳性,瓣膜内皮细胞血管性假血友病因子(Von Willebrand factor, vWF)和血小板内皮细胞粘附分子(Platelet-endothelial cell adhesion molecule, PEC AM)染色阳性。结论本研究探索的瓣膜间质细胞和内皮细胞分离培养方法简便、易行、重复性高,是一种理想的瓣膜细胞培养方法。目的建立体外瓣膜细胞钙化模型,诱导主动脉瓣间质细胞钙化,并观察钙化间质细胞表型变化。方法取传代4-8代间质细胞,随机分为2组,实验组以含p-甘油磷酸、维生素C、地塞米松的钙化培养基进行钙化诱导培养,对照组以标准培养基培养,培养2周。显微镜镜下行钙化结节计数,茜素红染色观察并半定量检测钙沉积,检测碱性磷酸酶活性,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real Time RT-PCR)检测间质细胞α-SMA及钙化相关因子(骨钙素,骨桥蛋白,核心结合因子al Cbfal)基因表达。结果间质细胞经钙化诱导培养2周可成功诱导钙化,实验组中间质细胞可自发形成钙化结节,数量显著高于对照组(156.25±17.38／孔VS 2.5±1.29／孔,P<0.05),钙沉积检测实验组显著高于对照组(17.52±2.04 VS1±0.22,P<0.05)；钙化诱导组碱性磷酸酶活性较对照组明显升高,2周时活性是对照组的2.3倍(P<0.01)。Real Time RT-PCR提示,实验组α-SMA、骨钙素、骨桥蛋白、Cbfal等mRNA表达水平均较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论瓣膜间质细胞可体外成功诱导钙化,钙化间质细胞呈现相对激活状态,表型向收缩表型和成骨表型转化,可能为瓣膜钙化的细胞学基础。目的构建瓣膜间质细胞和内皮细胞体外3D共培养钙化模型,观察瓣膜内皮细胞在间质细胞钙化过程中的调控作用。方法取4-8代间质细胞单独或与内皮细胞共种植于Ⅰ型胶原凝胶支架内,以含有p-甘油磷酸、维生素C、地塞米松的钙化培养基进行钙化诱导培养2周。测量凝胶向心性收缩评估瓣膜间质细胞收缩功能。茜素红染色观察并半定量检测钙沉积,Live/Dead试剂盒检测钙化细胞存活率,检测碱性磷酸酶活性,免疫荧光染色检测间质细胞表型激活(α-SMA), Real Time RT-PCR检测间质细胞α-SMA及钙化相关因子(骨钙素,骨桥蛋白,Cbfal) mRNA表达水平变化。结果成功构建间质细胞和内皮细胞3D共培养钙化模型。钙化诱导组间质细胞收缩能力强于对照组。茜素红钙沉积染色提示钙化诱导组基质内弥漫性钙化沉积,钙沉积明显高于对照组；凋亡检测和间质细胞表型检测提示钙化间质细胞呈现激活状态,伴随明显细胞凋亡发生以及α-SMA表达上调,碱性磷酸酶活性上升,并高表达骨钙素、Cbfal等钙化相关蛋白及转录因子;内皮细胞共培养可显著降低间质细胞钙沉积,减弱钙化间质细胞收缩能力,并下调α-SMA表达,降低碱性磷酸酶活性,抑制骨钙素、Cbfal等表达,保持骨桥蛋白相对高表达,使激活的间质细胞呈静息状态,缓解钙化。结论体外共培养瓣膜内皮细胞可缓解瓣膜间质细胞钙化的发生,其机制可能在于抑制间质细胞的激活表型变化,使间质细胞呈现相对静息状态。目的探讨并证实主动脉瓣间质细胞激活与瓣膜退行性钙化之间的相关性。方法收集换瓣手术中切除的老年钙化性退行性病变主动脉瓣作为实验组,以扩张型心肌病行心脏移植者主动脉瓣作为对照组。行HE染色观察瓣膜结构,Von Kossa染色观察瓣膜基质钙沉积,免疫组化染色观察Cbfal、骨钙素、α-SMA、波形蛋白表达及分布,逆转录PCR观察Cbfal和骨钙素mRNA表达情况。结果HE染色提示退行性钙化病变瓣膜胶原纤维增生,胶原束排列紊乱。Von Kossa染色提示钙化瓣膜间质内有明显散在点状钙沉积。免疫组织化学染色提示钙化瓣膜内Cbfal阳性表达,细胞外基质内骨钙素散在阳性表达。免疫荧光染色提示钙化瓣膜α-SMA染色阳性而无病变组为阴性或弱阳性。RT-PCR提示退行性钙化瓣膜中骨钙素和Cbfal均相对高表达,而正常瓣膜无表达,且两种mRNA表达强度成正相关。结论钙化瓣膜内间质细胞呈现激活状态,表型向成骨样表型转化。Cbfal与骨钙素表达强度成正相关,提示间质细胞的激活水平与钙化程度直接相关。

全文目录


缩略词表  6-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-15
前言  15-19
第一部分 主动脉瓣间质细胞和内皮细胞体外分离与培养  19-29
  一 材料与方法  19-22
  二 结果  22-23
  三 讨论  23-25
  参考文献  25-29
第二部分 主动脉瓣间质细胞体外诱导钙化模型的建立  29-45
  一 材料与方法  29-34
  二 结果  34-36
  三 讨论  36-38
  参考文献  38-45
第三部分 瓣膜内皮细胞体外调控间质细胞钙化的实验研究  45-67
  一 材料与方法  45-51
  二 结果  51-53
  三 讨论  53-58
  参考文献  58-67
第四部分 主动脉瓣间质细胞激活与瓣膜退行性钙化相关性的临床研究  67-79
  一 材料与方法  67-71
  二 结果  71-72
  三 讨论  72-74
  参考文献  74-79
结论与展望  79-81
综述  81-101
附录  101-102
致谢  102-104

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病
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