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新型抗炎蛋白TIPE2在乙型病毒性肝炎模型小鼠中的作用研究

作　者: 胡业佳
导　师: 刘素侠
学　校: 山东大学
专　业: 免疫学
关键词: TNFAIP8-2(TIPE2) 乙型病毒性肝炎 聚合酶链反应 免疫组化 蛋自质印迹
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究目的TIPE2(TNFAIP8L-2,tumor necrosis factor-αinduced protein-8-like 2,肿瘤坏死因子α诱导蛋白8型-2),是于2008年发现的一种新型的抗炎蛋白,对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用,其选择性表达于炎症组织和淋巴组织,可以防止超敏反应的发生,有效地维持机体内环境的稳定。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的一种世界性疾病,以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害,严重危害人类生命健康。但其确切的发生机制尚不明确,目前的研究认为,乙型肝炎病毒感染后激发的机体的细胞免疫机制是导致肝组织损伤的主要原因。本课题的主要研究目的是利用TIPE2基因敲除鼠建立乙型病毒性肝炎模型,研究负性调控分子TIPE2在乙型病毒性肝炎发生中的作用,以期进一步深入探讨乙型肝炎及其相关疾病发生的分子机制,为临床免疫干预乙型病毒性肝炎的病程进展及转归提供新的靶点。研究方法1.构建乙型病毒性肝炎小鼠模型利用TIPE2(?)小鼠及C57BL/6小鼠(野生型),经过尾静脉高压注射HBV的全基因表达质粒pcDNA3-1.1HBV,诱导急性乙型病毒性肝炎模型。TIPE2(?)小鼠由美国宾夕法尼亚大学陈有海教授惠赠,C57BL/6小鼠购自中国科学院上海斯莱克实验动物中心。用TIPE2(?)小鼠及C57BL/6小鼠各40只,分别于注射后0天、2天、4天、10天、15天处死小鼠,留取小鼠的血清,用生理盐水灌洗小鼠后,取新鲜肝组织分为两份,一份石蜡包埋制备病理切片,一份存放于液氮用于分子生物学检测。2.模型的鉴定检测HBV表达情况,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同时间点小鼠血清中HBsAg的表达。实时荧光定量PCR方法检测血清中的HBV DNA载量。取各时间点的小鼠肝脏抽提总RNA,逆转录成cDNA,利用RT-PCR方法检测TIPE2(?).小鼠及C57BL/6小鼠肝脏HBc mRNA的表达水平。具体方法是通过查找PubMed中人HBc基因序列,应用Primer 5.0软件,设计扩增HBcAg片段的特异性引物,再利用RT-PCR的方法从mRNA水平上检测小鼠肝脏中HBcAg的表达情况。用小鼠肝脏石蜡切片,免疫组化方法观察小鼠肝脏中HBcAg在肝细胞中的表达及分布情况。3.肝损伤的评价检测小鼠血清中ALT.AST的含量,取小鼠血清样本,通过检测TIPE2(?)小鼠及C57BL/6小鼠血清中的ALT.AST的含量的多少来分析判断乙肝造模小鼠肝损伤的状况。做小鼠肝脏石蜡切片,用HE染色方法观察TIPE2(?)小鼠及C57BL/6小鼠肝脏尾静脉高压注射质粒后不同时间点引起肝脏炎症损伤的状况,并分析在相同时间点两种小鼠炎症状况的表现差异。4.HBV感染对肝细胞表达TIPE2的影响提取小鼠肝脏中的总蛋白,利用Western blot的方法比较检测C57BL/6正常小鼠和乙肝造模小鼠肝脏中TIPE2蛋白的表达情况。用小鼠肝脏石蜡切片,免疫组化方法观察TIPE2在C57BL/6正常小鼠和乙肝造模小鼠肝脏肝细胞中的表达情况。研究结果1.尾静脉高压注射pcDNA3-1.1HBV质粒成功建立小鼠乙肝模型ELISA方法检测结果显示,尾静脉高压注射HBV全基因组表达质粒小鼠血清中HBsAg的水平明显高于正常对照小鼠(P<0.01),且乙肝造模后TIPE2(?)小鼠血清中HBsAg的水平高于C57BL/6小鼠血清中HBsAg的水平(P<0.05)实时荧光定量PCR方法检测血清中HBV DNA载量,结果发现在TIPE2(?)模型小鼠血清中HBV DNA载量显著高于C57BL/6对照鼠(P<0.05)。在乙肝造模后小鼠肝脏中检测到高水平的HBc mRNA,肝组织石蜡切片观察显示造模后小鼠肝细胞可散在高表达HBcAg。此研究结果提示,尾静脉高压注射HBV全基因组表达质粒的小鼠体内有HBV DNA的复制及抗原表达,并感染肝细胞,证实成功诱导了小鼠乙肝模型。2. TIPE2基因缺失后易于诱导乙肝形成分别在尾静脉高压注射HBV表达质粒的0、2、4、10、15天,处死动物检测血清中ALT.AST水平,结果发现造模后小鼠的血清ALT.AST水平明显高于正常对照小鼠(P<0.01),且TIPE2(?)小鼠血清中ALT.AST的水平显著高于C57BL/6小鼠肝炎模型小鼠(P<0.05),提示TIPE2基因缺失后,肝脏的炎症损伤加重。石蜡切片小鼠肝脏HE染色显示乙肝模型小鼠肝脏出现明显的炎症变化,可观察到肝细胞破坏,肝组织结构紊乱,大量的淋巴细胞浸润,此种现象在TIPE2基因缺失的小鼠更为严重。根据Knodell组织学评分判断,TIPE2(?)造模小鼠肝脏炎症损坏程度显著强于C57BL/6造模小鼠。3.HBV感染的肝细胞TIPE2表达增强Western blot检测结果显示C57BL/6乙肝造模小鼠肝脏TIPE2蛋白的表达亦明显高于C57BL/6正常小鼠(P<0.01)。免疫组化结果显示C57BL/6乙肝造模小鼠肝脏中散在肝细胞高表达TIPE2,且与HBcAg的表达一致。结论1.利用尾静脉高压注射HBV的全基因表达质粒,成功诱导了乙型病毒性肝炎小鼠模型；2.TIPE2负性调控乙型病毒性肝炎的发生：TIPE2基因缺失后的小鼠易于诱导乙型病毒性肝炎的发生,表现为与C57BL/6小鼠相比,其血清ALT.AST的表达明显增高,肝组织HE染色呈现更为严重的病理损伤。3.HBV感染的肝细胞,其TIPE2的表达增强。创新点1.提出新的论点：新型抗炎蛋白TIPE2负性调控乙型病毒性肝炎的发生；2.首次以TIPE2(?)小鼠诱导急性乙型肝炎动物模型,以研究TIPE2在乙型病毒性肝炎发生中的作用,属于原创性研究。

全文目录


中文摘要  6-10
Abstract  10-14
符号说明  14-15
前言  15-17
材料与方法  17-30
技术路线  30-31
结果  31-33
讨论  33-38
小结  38-39
附图  39-44
参考文献  44-49
综述  49-54
  参考文献  52-54
致谢  54-55
攻读学位期间发表的学术论文  55-62
学位论文评阅及答辩情况表  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性肝炎 > 乙型肝炎
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