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低氧诱导因子-1α在缺血后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤中的作用

作　者: 赵焕新
导　师: 刘慧荣；赵荣瑞
学　校: 山西医科大学
专　业: 生理学
关键词: 后处理 HIF-1α 缺血/再灌注 DMOG iNOS 高脂血症
分类号: R541
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景和目的世界卫生组织在《2007年全球卫生统计报告》中预测，到2030年缺血性心脏病将成为继癌症之后导致人类死亡的第二大疾病，而冠状动脉梗塞引起的心肌缺血是缺血性心脏病最重要的单因素致死原因。心脏是一个耗氧量很大的器官，且心肌不能进行无氧代谢，所以，当心肌缺血时，由于氧供给不能满足氧需求，会引起心肌细胞严重损伤，导致心肌舒缩功能障碍。因此，冠脉梗塞后及早再通闭塞的冠状动脉，有效恢复缺血心肌的血液灌注，是减少缺血性心肌损伤最有效的方法。然而动物实验和临床观察均证明，血管再通本身能引起额外的心肌损伤，即再灌注损伤，直接影响病人的预后。因此，如何减轻缺血/再灌注损伤，最大限度地保护缺血心肌，是有效治疗缺血性心脏病的关键。1986年Murry等提出心肌在经受多次短暂缺血－再灌后，能在随后的长时间缺血中延迟并减轻心肌损伤，即缺血预处理（preconditioning, PreC）。目前，预处理已经被公认为一种能够减轻缺血/再灌注损伤的内源性心肌保护措施。但是，这种预处理需要在心肌缺血之前进行，而在临床上，患者往往是在出现严重缺血甚至导致心肌梗塞后才来就诊，因此由于不能预测缺血的发生而使预处理的临床应用受到限制。2003年Zhao等首次提出了“缺血后处理”（ischemic postconditioning，PostC）的概念，即在长时间再灌注开始前，预先对心肌进行短暂、反复的再缺血-再灌注干预，也可以减轻随后的再灌注损伤。目前，后处理的保护效应已经在多种动物模型和临床观察中得到证实。由于后处理是在心肌缺血后进行，因此与缺血预处理相比更具有临床可行性，且操作简便，心肌保护效应明确，因而近年来已成为治疗缺血性心脏病的研究热点。后处理的保护机制非常复杂，涉及到多种因素的共同参与，但是哪一种因素在后处理的保护机制中起主导作用，迄今尚未充分阐明。对这一内容的研究，将有助于指导临床寻找诱导产生后处理样保护作用的切入点，从而改善心肌对缺血的耐受性，促进心功能的恢复。心肌缺血引起的病理生理变化非常复杂，而缺氧是其中起关键作用的一个环节。因此，调节氧供需的平衡对心功能的维持及心肌细胞的存活至关重要。近年来研究发现一种在氧平衡调节中起关键作用的转录因子——低氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1），它通过调节多种缺氧应激蛋白的基因表达来介导细胞对缺氧或/和缺血的适应性反应。HIF-1是一个包含有HIF-1α和HIF-1β两个亚基的异源二聚体，其中HIF-1α的蛋白稳定性和转录活性均受细胞内氧浓度的调节，而HIF-1β呈构成性表达，不受细胞氧浓度的调节，因此HIF-1的生理活性主要取决于其α亚基的表达和活性。在常氧状态下，HIF-1α在脯氨酸羟化酶(prolyl hydroylase, PHD)的作用下发生氧依赖性的羟基化反应而被诱导降解；在缺氧时由于其羟基化作用受到抑制而使HIF-1α在细胞内聚集并活化，促进其调控的靶基因转录，从而引起相应的缺氧适应性反应。大量的基础和临床研究表明，HIF-1α表达增加可能是心肌缺血/再灌注过程中最早期的分子水平上的适应性反应；机体在慢性缺氧时可以通过上调HIF-1α的表达使体内一些血管活性物质，如诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达增加，从而使机体适应缺氧环境。由此可见，HIF-1α表达增加对于心肌组织适应缺氧环境具有重要意义。最近，Eckle等研究证实HIF-1α在缺血预处理的心肌保护效应中发挥着中心作用。缺血预处理与缺血后处理有着许多相同的调节通路，那么缺血后处理时心肌组织中HIF-1α表达是否发生变化？如果是，是否也参与了后处理的保护机制？这些问题目前尚不明确。此外，有研究提示iNOS-NO-cGMP通路参与了缺血后处理的心肌保护机制。那么，iNOS作为HIF-1α重要的下游调节靶基因，缺血后处理过程中iNOS-NO-cGMP通路的激活是否与HIF-1α相关呢？对于这些问题的研究，不仅对进一步深入了解心肌缺血时基因调控水平的生理、病理变化机制有重要意义，而且对探讨后处理的内源性保护机制和开拓新的治疗思路也将有重要参考价值。目前对缺血性心脏病、以及缺血后处理的研究大多是利用健康动物模型来进行，但是在临床上，缺血性心脏病的发生往往是继发于一些疾病的基础上，其中高脂血症是一个重要的危险因素。那么，缺血后处理是否在与临床发病情况相似的病理模型中也起作用，则存在颇多争论。Martin等在对高脂饮食喂养的兔进行心脏离体灌流时发现，后处理可以减小缺血/再灌注造成的心肌梗死面积；而Iliodromitis等则发现后处理并不能改善高脂血症伴动脉粥样硬化兔的心肌梗死。但是，上述对后处理效应的研究基本上都是在高脂饲料喂养兔建立的高脂血症模型上通过对心脏进行离体灌流来观察，而且在研究时该模型高脂血症大多已发展为不同程度的动脉粥样硬化，而后者可能明显影响了对后处理效应的研究。然而，后处理对单纯高脂血症情况下在体的缺血/再灌注心肌是否具有保护效应，目前并不十分清楚。综上所述，HIF-1α在缺血/再灌注以及缺血预处理过程中蛋白表达量明显增加，但它在缺血后处理过程中表达如何、是否也参与后处理的保护机制、以及后处理对高脂血症状态下缺血/再灌注损伤的心脏是否同样具有保护效应等问题目前尚不清楚。在本研究中，我们运用TTC染色、CK活性检测，TUNEL和Caspase-3活性检测技术等方法观察缺血后处理大鼠的心梗面积、心肌组织损伤尤其是心肌细胞凋亡发生情况；运用免疫组化、免疫印迹、荧光定量PCR等方法观察大鼠缺血后处理心肌中HIF-1α及其下游靶基因iNOS的表达情况，以及这些变化与心肌损伤(以心肌梗死面积为代表)之间的关系；通过运用PHD抑制剂DMOG稳定HIF-1α表达以及siRNA技术沉默HIF-1α，分别观察缺血后处理对心肌细胞损伤、细胞存活等的影响，以进一步探讨HIF-1α在后处理保护机制中的作用；用食源性高脂血症大鼠模型，观察后处理对高脂血症状态下缺血/再灌注损伤的心肌是否具有保护作用。通过上述研究，我们期望证实如下假设：(1)缺血后处理是减轻缺血/再灌注导致的心肌损伤的有效措施；(2) HIF-1α是缺血后处理保护缺血心肌的重要调节因子，在后处理心肌中其表达及转录活性增强，且其作用可能通过iNOS-NO-cGMP途径实现的；(3)缺血后处理可以减轻高脂血症情况下缺血/再灌注导致的心肌损伤。一、后处理对缺血/再灌注心肌组织HIF-1α表达的影响目的1、观察后处理对缺血/再灌注心肌组织HIF-1α表达的影响；2、分析HIF-1α表达水平与再灌注心肌损伤之间可能存在的关系。方法1、选取成年Wistar大鼠30只，随机分为以下3组：(1)伪手术组(Sham，n=10)：在冠状动脉左前降支（LAD）下穿线，不结扎，持续210min；(2)缺血/再灌注组(Control，n=10)：冠状动脉左前降支下穿线结扎造成缺血30min，松开结扎线再灌注180min；(3)缺血后处理组(PostC，n=10)：结扎LAD缺血30min，随即进行10s再灌注+10s再缺血，重复3次，随后再进行180min再灌注。2、心肌梗死面积测定：采用Evans blue和TTC双染法，正常的心肌组织被染成蓝色，缺血但未梗死的心肌组织被染为红色，梗死的心肌组织为白色。图像分析测定各区域面积。危险区面积（AAR/LV，%）=（危险区总面积/左心室面积）×100%心梗面积（An/AAR，%）=（梗死区面积/危险区总面积）×100%3、测定血清肌酸激酶（CK）的活性来进一步反映心肌损伤情况；4、分别采用原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3活性测定法检测大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况；5、用Western-blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α与iNOS的蛋白表达水平；6、用免疫组化法测定心肌组织中HIF-1α的定位及表达；7、用real-Time PCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1α与iNOS mRNA的表达水平。结果1．后处理可以减轻缺血/再灌注所致的心肌损伤以危险区面积占左心室面积的百分比(即AAR/LV比值)作为判别心肌缺血程度的指标，发现各实验组间的AAR/LV均无显著差异(P>0.05)，表明各组动物模型的缺血程度大体相同，因而在此实验模型基础上的实验结果具有可比性(图1A)。1.1后处理可以减小心肌梗死面积对健康Wistar大鼠结扎冠状动脉左前降支进行30min缺血，松开结扎再灌注180min后，显示心肌梗死面积占危险区总面积约36%，而在再灌注前预先给予10s的再灌注+10s再缺血，重复三次(即缺血后处理)，心肌梗死面积则明显减小，约占危险区总面积27.3%，表明后处理减少了再灌注区域中死亡的心肌细胞，由此提示后处理对缺血/再灌注心肌可能具有一定的保护作用(图1B)。1.2后处理可以降低血清肌酸激酶(CK)的活性急性心梗发生后，由于心肌缺血坏死或细胞膜通透性增加，使得心肌内的细胞酶释放入血，因此可以根据血清酶的变化来反映心梗的发生以及心肌损伤的程度。由于CK是心肌细胞中特异性最高的酶，因此本实验采用CK活性作为评价心肌损伤的一项指标。经30min缺血/180min再灌注，血清CK活性明显增加(0.48±0.04U/ml)，而后处理则显著降低了血清CK活性(0.38±0.06U/ml , P<0.05，图2)。这一结果提示，后处理可能通过稳定细胞膜而减轻了心肌细胞的损伤。1.3后处理使心肌细胞凋亡减少缺血/再灌注造成的心肌梗死区存在着坏死和凋亡两种形式的细胞死亡，而不可逆转的心肌细胞凋亡又可进一步扩大再灌注心肌的梗死面积，由于细胞凋亡这种基因调控、高度有序的细胞主动死亡过程与坏死相比，更具有可控制性和特异性，因此本研究将减少心肌细胞凋亡作为切入点，运用TUNEL染色法和Caspase-3活性测定法来反映后处理对缺血/再灌注所致心肌细胞凋亡的影响。TUNEL染色结果显示，缺血/再灌注使心肌组织中大约17.68%的细胞发生凋亡，而后处理则使凋亡的心肌细胞减少到11.34%(P<0.01，图3)。TUNEL这种检测细胞凋亡的方法虽然比较灵敏但特异性较低，因此我们又测定了细胞凋亡最后通路的关键蛋白Caspase-3的活性，后者可以定量反映细胞凋亡发生情况。以Sham组大鼠Caspase-3活性为1进行比较，结果显示，与缺血/再灌注组(3.79±0.64)相比，后处理显著降低了Caspase-3比活性(1.85±0.5，P<0.01，图4)。这一结果说明，后处理可以减少缺血/再灌注导致的心肌细胞凋亡。以上结果提示，后处理可能通过稳定心肌细胞膜、减少心肌细胞凋亡等方式明显减轻了缺血/再灌注导致的心肌损伤。2．后处理对缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α表达的影响2.1后处理提高了缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α的蛋白水平用Western-blot方法检测缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α的蛋白表达水平。结果显示，伪手术组大鼠心肌组织中检测到微量的HIF-1α蛋白表达，这是由于在非缺氧状态下HIF-1α蛋白被快速降解，因而在心肌组织近乎检测不到其蛋白水平。当给予心脏30min缺血/180min再灌注后，心肌组织中HIF-1α的蛋白含量明显增加，达到伪手术组的2.85倍；而给予后处理后，HIF-1α的蛋白水平进一步提高到伪手术组的5.76倍(P<0.01，图5)。这一结果提示，心脏经过长时间缺血之后，后处理仍然可以触发HIF-1α蛋白的表达。为了观察后处理上调的HIF-1α蛋白在心肌组织的定位，我们对缺血/再灌注以及后处理的心肌组织进行了免疫组织化学检测。结果显示，缺血/再灌注之后大量HIF-1α蛋白聚集于心肌细胞核内，而后处理则更进一步增加了心肌细胞核内HIF-1α的聚集(图6)。2.2后处理对心肌组织中HIF-1αmRNA水平的影响为进一步观察后处理上调HIF-1α是否是在基因水平上的调节，本研究运用realtime-PCR方法检测了各组动物心肌组织中HIF-1αmRNA水平的变化。结果显示，HIF-1αmRNA水平在各组间均无明显差异(P>0.05，图7，图8)。以上结果提示，后处理上调心肌组织HIF-1α蛋白水平是在其翻译后水平而非基因水平上的调节。2.3后处理对缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α下游调节基因---iNOS表达的影响为了明确后处理上调的HIF-1α其转录活性是否发生变化，本研究选取了iNOS这一重要的HIF-1α下游调节基因，通过检测其mRNA及蛋白水平的表达，以反映HIF-1α的转录活性。由图9，图10可见，与HIF-1α蛋白水平的变化趋势相一致，缺血/再灌注使心肌组织iNOS的mRNA表达增加3.75倍，而后处理使其进一步增加到10.39倍。Western blot检测结果也显示，缺血/再灌注使心肌组织中iNOS蛋白水平增加，而后处理更进一步增加了iNOS的蛋白表达(图11)。这一结果提示，后处理不仅使心肌组织中HIF-1α的蛋白含量上调，而且使其转录活性也明显增强。3．缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α蛋白水平与心肌梗死面积相关为进一步探讨缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α蛋白水平的改变与心肌损伤程度之间是否有关，我们对HIF-1α蛋白水平(采用Western-blot这种半定量分析方法测定)与反映心肌缺血/再灌注损伤的金指标---心肌梗死面积之间作相关性分析。结果显示，随着心肌组织中HIF-1α蛋白水平的增加，心梗面积呈现减小趋势，二者之间存在着显著的负相关(r=-799,P<0.01，图12)。这一结果提示，后处理减轻心肌损伤，可能与其上调了HIF-1α蛋白水平有关。1、与缺血/再灌注相比，后处理使心肌组织中HIF-1α蛋白水平显著上调；2、后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤可能与其上调HIF-1α表达有关。二、HIF-1α表达改变可以影响后处理对缺血心肌的保护效应目的1、采用药理学方法(DMOG，脯氨酸羟化酶的抑制剂)使心肌组织中HIF-1α表达上调，观察其对后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤的影响；2、模拟心肌缺血/再灌注，在培养的心肌细胞上制备缺氧/复氧及缺氧后处理模型，然后利用RNAi技术使心肌细胞的HIF-1α基因沉默，观察后处理对缺氧/复氧所致心肌细胞损伤的影响。方法1、选取成年Wistar大鼠40只，随机平均分为以下4组：(1)缺血/再灌注组(Control，n=10)：结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血30min，松开结扎线恢复再灌注180min；(2) DMOG+缺血/再灌注组(DMOG+Control, n=10)：缺血前24h腹腔注射DMOG(40mg/kg，溶于生理盐水中)，然后给予缺血30min，再灌注180min；(3)生理盐水+后处理组( Vehicle+PostC, n=10)：缺血前24h腹腔注射生理盐水,然后给予缺血30min,再灌注10s+再缺血10s，重复三次后，再灌注180 min；(4) DMOG+后处理组(DMOG+PostC, n=10)：缺血前24h腹腔注射DMOG(40mg/kg)，其余操作同(3)。2、心肌梗死面积测定：采用Evanse blue和TTC双染法测定缺血/再灌注所致的心肌梗死面积；3、测定血清肌酸激酶（CK）的活性来进一步反映心肌损伤情况；4、采用Caspase-3活性测定法反映大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况；5、用Western-blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOS的蛋白表达水平；6、用real-Time PCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOS mRNA的表达水平；7、采用放射免疫法检测各组大鼠心肌组织中cGMP含量；8、利用培养的H9c2心肌细胞模拟心肌缺血/再灌注建立缺氧/复氧及缺氧后处理模型：(1)常氧对照组：置于37℃95 %空气，5 % CO2中持续培养5h；(2)缺氧/复氧组：置于充满95 % N2和5% CO2的三气培养箱内缺氧培养3h，然后再转入充满95 %空气，5 % CO2的常氧培养箱中复氧2h；小结(3)缺氧后处理组：缺氧培养3h后，复氧5min+缺氧5min，重复三次，然后再复氧培养1.5h；(4) DMOG+缺氧后处理：缺氧前在培养液中分别加入不同量的DMOG，使其终浓度分别为0.1mM, 0.5mM以及1mM，其余操作同(3)；9、检测心肌细胞存活率（CCK8法），培养液上清中乳酸脱氢酶（LDH）活性变化以及caspase-3活性来反映缺氧/复氧及缺氧后处理对心肌细胞的影响；10、利用RNAi技术使培养的心肌细胞HIF-1α基因沉默。结果在常氧状态下，HIF-1α在脯氨酸羟化酶(PHD)的作用下发生羟基化而被诱导降解；在缺氧时，由于PHD的活性受到抑制而使HIF-1α降解被阻断，从而使后者在细胞内聚集、活化。DMOG是HIF-1α-PHD的抑制剂，它通过抑制PHD的活性而使HIF-1α的降解受到抑制，从而使其在细胞内聚集。为了进一步阐明HIF-1α蛋白水平与后处理心肌保护效应之间的关系，我们通过给予DMOG来上调心肌组织HIF-1α的蛋白水平，从而观察其对后处理减轻缺血/再灌注心肌损伤效应的影响。1、DMOG对心肌组织中HIF-1α表达的影响1.1 DMOG明显提高了心肌组织中HIF-1α蛋白的含量与单纯缺血/再灌注(Control)组相比，给予DMOG后心肌组织中HIF-1α蛋白含量显著增加，是单纯缺血/再灌注的2.09倍，但其促进HIF-1α含量增加的程度与单纯后处理(使HIF-1α表达增加2.02倍)无明显差别。而给予DMOG后再给予后处理，则更进一步提高了心肌组织HIF-1α的蛋白水平，是单纯缺血/再灌注组的3.28倍(P<0.01，图13)。表明DMOG与后处理均可增加心肌组织HIF-1α蛋白含量，且二者具有叠加效应。1.2 DMOG不影响心肌组织中HIF-1αmRNA水平的表达为了进一步证实DMOG上调HIF-1α表达不是发生在基因水平上的调节，我们用Realtime-PCR方法检测了给药前后各组大鼠心肌组织中HIF-1αmRNA水平的变化。结果显示，给予DMOG后，缺血/再灌注组与后处理组大鼠心肌组织中HIF-1α的mRNA水平与给药前相比均未发生改变(图14,图15)。这些结果说明DMOG只是通过抑制HIF-1α蛋白降解而使其蛋白水平增加，并不影响HIF-1α基因表达。2、DMOG对后处理减轻缺血/再灌注心肌损伤效应的影响2.1 DMOG进一步增强了后处理减小缺血/再灌注心肌梗死面积的效应与单纯缺血/再灌注组所致的心肌梗死面积(36±4.9%)相比，给予DMOG后，使缺血/再灌注所致的心梗面积减小25.7%(An/AAR约为26.7±2.5%)，说明DMOG使心肌组织HIF-1α增加后可明显缩小心梗面积。单纯后处理使心梗面积减小24.2%，这与DMOG的效应相同，且二者之间无明显差别。而给予DMOG后再进行后处理干预，则使后处理减轻心肌梗死的效应进一步增强，心梗面积约减小50% (图16)。提示，DMOG上调心肌组织HIF-1α表达之后，进一步增强了后处理减轻心肌梗死的效应。2.2 DMOG使后处理降低血清CK活性的效应进一步加强当心肌细胞受到损伤之后，可以将CK由细胞内释放到血液中，而红细胞中几乎不含CK，因此，我们通过测定血清中CK活性来作为评价心肌损伤的另一个重要指标。结果显示，给予DMOG后，缺血/再灌注组及后处理组大鼠血清中CK活性与给药前相比均显著降低，与减小心梗面积的效应相同，且DMOG与后处理在降低CK活性方面也具有叠加效应(图17)。2.3 DMOG进一步提高了后处理降低缺血/再灌注心肌Caspase-3比活性的作用同减小心梗面积及血清CK活性的效应相同，DMOG使缺血/再灌注组大鼠心肌组织Caspase-3比活性显著降低(2.02±0.65 vs. 3.79±0.64，P<0.01)，其降低程度与单纯后处理的效应(1.85±0.55)相同；而在后处理前预先给予DMOG，则与单纯后处理相比更进一步使Caspase-3比活性降低(0.43±0.13, P<0.01，图18)。结果提示，随着DMOG与后处理上调心肌组织中HIF-1α的表达，缺血/再灌注导致的心肌细胞凋亡明显减少。以上结果表明，给予DMOG后可以上调HIF-1α表达，同时可以减轻缺血/再灌注所致的心肌损伤，且其减轻程度与单纯后处理相同；而在后处理之前预先给予DMOG，则使HIF-1α的表达进一步上调，同时后处理对缺血心肌的保护效应也进一步提高，显示了DMOG与后处理具有叠加效应。由此进一步提示，心肌组织中HIF-1α的蛋白水平可能与后处理的心肌保护效应有关。2.4 DMOG使后处理心肌组织中iNOS表达进一步增加前面的研究结果已经显示，后处理显著提高了缺血/再灌注心肌组织中iNOS的蛋白水平与mRNA水平。为进一步证实这种效果是否与HIF-1α有关，我们给予DMOG进行了观察。结果显示，与心肌组织中HIF-1α表达的变化趋势相一致，缺血/再灌注组与后处理组均比给药前明显增加了iNOS在蛋白水平及mRNA水平的表达，而且DMOG与后处理对iNOS表达的影响也具有累加效应(图19，图20，图21)。2.5 DMOG使后处理心肌组织中cGMP含量显著升高我们以cGMP作为指标，观察在不同实验条件下iNOS-cGMP信号转导通路的激活程度。结果显示，缺血/再灌注的心肌组织cGMP含量为1.1±0.03 pmol/mg，后处理使cGMP含量明显增加(2.02±0.13 pmol/mg，P<0.05)。而给予DMOG后，进一步提高了缺血/再灌注和后处理增加cGMP含量的效应，即DMOG+Control组cGMP含量达到1.86±0.26pmol/mg，而DMOG+PostC组为2.74±0.34 pmol/mg，其变化趋势与HIF-1α完全一致(图22)。以上结果表明，随着后处理及DMOG上调HIF-1α的表达，HIF-1α下游iNOS-cGMP通路也发生了相应的改变，提示HIF-1α可能通过iNOS-cGMP途径参与了后处理的心肌保护机制。3、HIF-1α基因沉默可以削弱后处理对缺氧/复氧心肌细胞的保护效应为进一步验证HIF-1α是否确实参与了后处理的保护效应，我们模拟在体状态下的心肌缺血/再灌注，在培养的心肌细胞上制备了缺氧/复氧及缺氧后处理模型，并利用RNAi技术使心肌细胞HIF-1α基因沉默，以观察其对后处理效应的影响。3.1培养的心肌细胞(H9c2细胞)缺氧/复氧及缺氧后处理模型的建立H9c2细胞是一株来源于胚胎大鼠心肌组织的细胞系，目前已经被广泛应用于缺氧/复氧信号通路的研究。将该细胞置于含95% N2-5% CO2的低氧环境中培养3h,再置于含95%空气-5% CO2的常氧环境中复氧2h后，细胞存活率降低为常氧培养(其细胞存活率假定为100%)时的46%(P<0.01)；而在复氧前预先给予三个循环的5min复氧+5min缺氧处理(即后处理)，心肌细胞存活率则可上升为为常氧培养时的76% (图23)。当心肌细胞受到损伤时，细胞内的乳酸脱氢酶(LDH)释放到培养液中，因此可以通过测定细胞培养液中LDH的活性/漏出量来反映心肌细胞的损伤情况。H9c2细胞经受缺氧/复氧后，培养液中LDH活性明显升高，达96.7U/ml(P<0.01)；而与缺氧/复氧组相比，后处理则使LDH的漏出量降低到57.1U/ml (P<0.01，图24)。在缺氧前预先在细胞培养液中加入不同浓度的DMOG后再进行缺氧后处理，结果显示，与给药前相比，细胞损伤程度(包括细胞存活率及LDH活性)呈浓度依赖性下降(图23，图24)。以上结果表明，缺氧/复氧对心肌细胞造成明显的损伤，而缺氧后处理则可显著减轻这种损伤。提示，模拟在体情况下的心肌缺血/再灌注建立的心肌细胞缺氧/复氧模型已经基本成功。3.2心肌细胞HIF-1α基因沉默对缺氧后处理的影响将3对设计合成的siRNA-HIF-1α序列分别转染至培养的心肌细胞，经48-72h培养后检测细胞内HIF-1αmRNA水平，其中一对siRNA序列转染后可以使心肌细胞内HIF-1αmRNA表达显著下降(图25)，确定其为有效的siRNA序列。利用这对有效的siRNA序列转染细胞，使细胞内HIF-1α基因沉默后，再进行缺氧后处理。结果显示，后处理降低LDH活力的效应明显下降（79.91±7.36U/ml in siRNA-PostCvs. 58.3±7.46U/ml in PostC, P<0.01，图26），同时caspase-3比活性明显增加（8.06±0.35 vs.4.21±1.41, P<0.01，图27）。这些结果提示，HIF-1α基因沉默后，后处理的细胞保护效应明显下降，说明HIF-1α参与了后处理的保护机制。小结1、DMOG使心肌组织中HIF-1α蛋白水平上调，其上调程度同后处理的效应相同，而给予DMOG后再进行后处理，则可更进一步增加HIF-1α的蛋白表达，提示DMOG与后处理在增加HIF-1α表达方面具有叠加效应。给予DMOG并不影响HIF-1αmRNA的表达，说明其是在翻译后水平上对HIF-1α进行调节；2、DMOG通过上调HIF-1α蛋白水平减轻了缺血/再灌注导致的心肌损伤，而且更进一步增强了后处理的保护效应，表现出DMOG与后处理的叠加效应，进一步提示HIF-1α表达上调与后处理的心肌保护机制可能存在着一定的联系；3、DMOG上调心肌组织HIF-1α表达，以及增强后处理保护效应的同时，心肌组织iNOS表达与cGMP含量均发生相应的增加，提示HIF-1α可能通过其下游iNOS-cGMP通路参与后处理的保护机制；4、HIF-1α基因沉默后，削弱了后处理对缺氧/复氧所致心肌细胞损伤的保护效应。三、后处理可以减轻高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤目的1、建立食源性高脂血症大鼠模型，观察高脂血症对心肌缺血/再灌注损伤是否具有影响；2、观察后处理是否可以影响高脂血症大鼠缺血/再灌注所致的心肌损伤；3、观察高脂血症对心肌组织中HIF-1α表达的影响。方法1、选取成年Wistar大鼠60只，体重120±10g，随机平均分为以下两大组：(1)正常饮食组(N=30)：普通饲料喂养8周，分别随机分为以下3组①正常饮食-伪手术组(N-Sham，n=10)：仅在冠状动脉左前降支（LAD）下穿线，不结扎，持续210min；②正常饮食-缺血/再灌注组(N-Control，n=10)：缺血30min,再灌注3h；③正常饮食-缺血后处理组(N-PostC，n=10)：结扎LAD 30min，随即进行10s再灌注+10s缺血，重复3次，随后再进行3h再灌注。(2)高脂血症组(N=30)：高脂饲料喂养8周后鼠尾采血测定血脂水平，随机平均分为以下3组①高脂血症-伪手术组(HC-Sham, n=10)：手术操作同(1)①；②高脂血症-缺血/再灌注组(HC-Control，n=10)：手术操作同(1)②；③高脂血症-缺血后处理组(HC-PostC，n=10)：手术操作同(1)③。2、采用比色法测定血脂水平；3、心肌梗死面积测定：采用Evanse blue和TTC双染法测定心肌梗死面积；4、测定血清肌酸激酶（CK）的活性来进一步反映心肌损伤情况；5、采用Caspase-3活性测定法反映大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况；6、用Western-blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOS的蛋白表达水平；7、用real-Time PCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOS mRNA的表达水平。结果、高脂饲料喂养8周后大鼠血脂水平升高与以往采用家兔来建立高脂血症模型的研究不同，我们采用大鼠来建立食源性高脂血症模型，由于大鼠的高脂血症不会进展为动脉粥样硬化，因此避免了动脉粥样硬化对随后我们进行的缺血后处理研究的影响。60只大鼠在高脂饲料喂养前血脂水平无明显差异(表1)，将其随机平均分为两组喂养，其中经高脂饲料喂养8周后的30只大鼠，其血脂水平显著升高，血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和低密度脂蛋白(LDL)水平均显著高于同期普通饲料喂养的大鼠血脂水平P<0.05，表2 )，表明高脂血症大鼠模型已成功建立。、高脂血症增强了心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性2.1高脂血症使缺血/再灌注所致的大鼠心肌梗死面积进一步增加与普通饲料喂养8w的大鼠(33.38±1.4%)相比，高脂饲料喂养大鼠8w后，缺血/再灌注导致的大鼠心肌梗死面积明显扩大(39.5±1.16%，P<0.05，图28)。2.2高脂血症进一步增加了缺血/再灌注大鼠血清中CK的活性在正常饮食组和高脂血症组，缺血/再灌注均可使血清CK活性明显升高，但高脂血症可以进一步提高缺血/再灌注大鼠血清CK活性(HC+Control组0.56±0.06 U/ml vs.N-Control组0.47±0.04 U/ml，P<0.01，图29A)。2.3高脂血症使缺血/再灌注大鼠心肌的Caspase-3活性增加与正常饮食组相比，高脂血症可以使缺血/再灌注大鼠心肌Caspase-3活性进一步增加HC+Control组4.63±0.42 vs. N-Control组2.31±0.27, P<0.01)，表明高脂血症本身即可能引起心肌细胞凋亡(图29B)。以上结果提示，高脂血症增强了心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性。3.1后处理可以缩小高脂血症大鼠缺血/再灌注所致的心肌梗死面积在正常饮食组和高脂血症组，后处理均可减小缺血/再灌注导致的心肌梗死面积，分别减小25.6%和25.1%，且两组减小程度无差异(图30)。3.2后处理可以降低高脂血症大鼠缺血/再灌注血清的CK活性在观察到后处理对心梗面积影响的同时，我们通过检测血清中CK的活性作为评价心肌损伤的另一个极为重要的标志，以进一步证实后处理对高脂血症情况下缺血/再灌注心肌损伤的影响。结果显示，同减小心梗面积的效应一致，后处理不仅可以降低正常饮食大鼠缺血/再灌注后的血清CK活性，同样也可以显著降低高脂血症大鼠缺血/再灌注后的血清CK活性(P<0.01，图31A)。3.3后处理可以降低高脂血症大鼠缺血/再灌注心肌组织的Caspase-3比活性与正常饮食-缺血/再灌注组(2.31±0.27)相比，高脂血症增加了缺血/再灌注所致的心肌组织Caspase-3活性(4.63±0.42)，而后处理则可明显降低高脂血症大鼠心肌Caspase-3活性(1.94±0.21，P<0.01，图31B)。以上结果提示，后处理可以减轻高脂血症大鼠缺血/再灌注导致的心肌损伤，而且后处理减轻高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤的程度明显超过其对正常饮食大鼠的作用。4、高脂血症对心肌组织HIF-1α表达的影响4.1 HIF-1α蛋白表达的改变在高脂血症大鼠，伪手术组HIF-1α蛋白水平与正常饮食伪手术组相比明显升高(1.34±0.22 vs. 0.64±0.16, P<0.05)；在高脂血症与正常饮食组，缺血/再灌注均可使HIF-1α蛋白表达进一步增加，但高脂血症缺血/再灌注组(2.41±0.41)明显高于正常饮食缺血/再灌注组(1.82±0.13, P<0.01)；推测高脂血症本身可能会导致一定程度的心肌缺氧。后处理进一步增加了HIF-1α蛋白的表达，其增加程度在高脂血症与正常饮食组之间没有差异(图32)。4.2 HIF-1αmRNA表达的改变为进一步阐明高脂血症与后处理上调HIF-1α蛋白水平是否是在基因水平上的调节，我们采用real time-PCR方法测定HIF-1αmRNA水平的表达。结果显示，无论是在高脂血症组还是在正常饮食组，缺血/再灌注与后处理均未影响心肌组织中HIF-1αmRNA水平的表达，各组间HIF-1αmRNA水平无明显差异(图33，图34)。提示，缺血/再灌注和后处理以及高脂血症对HIF-1α表达的影响均发生在其翻译后水平而非基因水平。4.3 HIF-1α下游靶基因iNOS表达的改变在观察到高脂血症上调心肌组织HIF-1α表达的同时，我们分别应用Western-blot与realtime-PCR方法检测了HIF-1α下游靶基因iNOS的表达。结果显示，与正常饮食组相比，3、后处理对高脂血症大鼠缺血/再灌注所致的心肌损伤的影响高脂血症显著提高了缺血/再灌注及后处理心肌组织中iNOS的蛋白水平及mRNA水平，其变化趋势与HIF-1α一致(图35，图36,图37)。这一结果提示，高脂血症与后处理均可能通过上调HIF-1α而增加iNOS的表达。以上结果提示，后处理减轻高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤可能与心肌HIF-1α的表达水平有关，而HIF-1α可能通过其下游调节基因iNOS来参与后处理对高脂血症大鼠缺血/再灌注心肌的保护机制。小结1、后处理可以减轻高脂血症大鼠缺血/再灌注造成的心肌损伤；2、高脂血症及后处理均可上调心肌组织中HIF-1α的蛋白水平，后处理减轻高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤可能与HIF-1α表达水平增加有关。

低氧诱导因子-1α在缺血后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤中的作用

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