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丁基苯酞治疗与预防肌萎缩侧索硬化SOD1-G93A转基因小鼠的实验研究 正常人外周静脉血SOD1蛋白表达水平的检测

作　者: 冯新红
导　师: 崔丽英
学　校: 北京协和医学院
专　业: 神经病学
关键词: 丁基苯酞 肌萎缩侧索硬化 生存期 氧化应激 神经保护 SOD1蛋白 SOD活性 阿尔茨海默病 帕金森病 正常人
分类号: R744
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


第一部分：丁基苯酞治疗与预防肌萎缩侧索硬化SOD1-G93A转基因小鼠的实验研究背景：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种选择性的累及上下运动神经元的致死性的神经变性疾病。该病好发于成年人,起病隐袭,逐渐进展,平均生存期约为3-5年。ALS的发病机制尚不明确,可能与以下几个因素有关：①铜锌超氧化物岐化酶(Cu/Zn SOD, SOD1)基因突变；②谷氨酸的兴奋毒作用；③线粒体功能异常；④氧化应激：⑤炎症反应；⑥凋亡；⑦非运动神经元的参与等。对ALS发病机制和治疗方法的探讨一直是神经科领域的研究热点。氧化应激和炎症被认为是ALS发病的主要机制。目前ALS尚无有效治疗方法。丁基苯酞(DL-3-n-butylphathlide, DL-NBP)是中国医学科学院药物研究所研制开发第一个具有自主知识产权的抗脑缺血一类新药,目前已经广泛的应用于临床。研究结果显示丁基苯酞可能通过减少氧化应激和炎症反应、抑制神经元凋亡、改善线粒体功能等作用机制,对脑缺血性所致中枢神经功能的损伤起到改善作用。既往丁基苯酞的研究主要集中在急慢性脑缺血,对于ALS的研究未见报道。目的：本研究中,我们采用ALS转基因小鼠模型,观察丁基苯酞对小鼠生存期和运动功能障碍的改善作用,并对其作用机制进行初步的探讨。为开发丁基苯酞成为治疗ALS的药物提供理论依据。方法：本实验以ALS-SOD1G93A转基因小鼠为实验对象,应用Jackson实验室提供的引物和方案进行PCR鉴定ALS-SOD1G93A转基因小鼠。观察ALS-SOD1G93A转基因小鼠的表型特征；联合应用悬尾试验、称重、转棒实验和悬线实验,来观察ALS-SOD1G93A转基因小鼠的发病时间和生存期。测定ALS-SOD1G93A转基因小鼠腓肠肌复合肌肉动作电位(compound muscle action potential, CMAP),应用统计法运动单位数目计数(motor unit number estimation, MUNE)观察腓肠肌运动单位的数目。焦油紫尼氏染色计数ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰段脊髓前角的运动神经元。免疫荧光染色观察ALS-SOD1G93A转基因小鼠脊髓前角小胶质细胞和星形胶质细胞的激活以及cleaved Caspase-3蛋白的表达。HE染色观察ALS-SOD1G93A转基因小鼠腓肠肌的形态变化,Luxol fast blue中性红髓鞘染色观察小鼠坐骨神经形态的改变。通过Western blotting方法分析了ALS-SOD1G93A转基因小鼠脊髓核因子-E2相关因子2(Nuclear factor-erythroid 2 related factor 2, Nrf2)、核因子-κB (Nuclear factor-kappa B, NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors-a, TNF-a)、细胞色素c (cytochrome-c)、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果：丁基苯酞60mg/kg治疗组ALS-SOD1G93A转基因小鼠的生存期为164.78±16.672天,而溶剂对照小鼠的平均生存期140.00±16.892天,丁基苯酞60mg/kg治疗组小鼠的生存期延长了24天(P<0.05)。丁基苯酞60mg/kg预防给药使得ALS-SOD1G93A转基因小鼠的生存期由158.40±7.436天,延长到177.20±15.881天(P<0.05),发病时间延缓了10天(P<0.05)。丁基苯酞60mg/kg治疗能够明显延缓ALS-SOD1G93A转基因小鼠的体重丢失(P<0.05),使小鼠的转棒实验和悬线实验功能的损伤速度减缓(P<0.05)。丁基苯酞30mg/kg和120mg/kg治疗给药没有看到显著作用。与溶剂对照组(12.8±7.15 mv)相比,60mg/kg丁基苯酞治疗给药能增加腓肠肌CMAP的波幅(18.2±7.27mv),但没有达到统计学意义(P=0.209)。溶剂对照组ALS-SOD1G93A转基因小鼠20周龄腓肠肌MUNE是(63.2±31.87)个,60mg/kg丁基苯酞治疗给药能延缓腓肠肌MUNE(110.5±9.68个)减少的速度(P<0.05)。尼氏染色观察到20周龄溶剂对照组小鼠脊髓前角运动神经元数是(9.5±2.92),丁基苯酞60mg/kg能够明显减轻ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰段脊髓前角运动神经元的丢失(16.8+2.64,p<0.01)。免疫荧光染色发现溶剂对照组ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓小胶质细胞CD11b和星形胶质细胞神经胶质酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein, GFAP)免疫阳性明显增强,胞体明显增大,提示为激活状态的胶质细胞,丁基苯酞60mg/kg则显著抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。同时免疫荧光染色提示ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰段脊髓cleaved Caspase-3的表达是增加的,丁基苯酞60mg/kg组小鼠脊髓cleaved Caspase-3的免疫阳性明显降低。Western blotting分析提示丁基苯酞60mg/kg明显抑制ALS-SOD1G93A转基因小鼠脊髓NF-κBp65和TNF-a的表达,轻度上调Nrf2的表达。丁基苯酞还抑制Bax和cytochrome-c蛋白的表达,上调Bcl-2的表达。结论：1丁基苯酞能延缓ALS-SOD1G93A转基因小鼠的发病,显著延长生存期,延缓运动功能减退；2丁基苯酞能减慢ALS-SOD1G93A转基因小鼠腓肠肌运动单位数目的降低；3丁基苯酞能减慢ALS-SOD1G93A(?)基因小鼠脊髓前角运动神经元的丢失；4丁基苯酞能抑制ALS-SOD1G93A转基因小鼠脊髓前角胶质细胞的激活；5丁基苯酞可能通过抗炎症和抗凋亡的作用对ALS-SOD1G93A转基因小鼠产生一定的神经保护作用。6丁基苯酞对ALS-SOD1G93A转基因小鼠有一定的治疗作用和预防作用。第二部分：正常人外周静脉血SOD1蛋白表达水平的检测背景：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶,是生物体内一种重要的氧自由基清除剂,其作用可以特异性地催化氧自由基发生歧化反应,清除有毒性作用的自由基,使其产生和清除处于动态平衡之中。肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种致死性的神经系统变性疾病。目前发现ALS患者中SOD 1基因突变已经达到150多种。研究证实ALS是突变的SOD1“获得性毒性功能”而并不是SOD1活性改变的发病机制。近来研究发现在阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)和帕金森病(Parkinson disease, PD)患者脑组织中总的和氧化的SOD1水平均明显增高,提示了SOD1参与了AD和PD的氧化应激损伤过程。研究SOD1在神经变性病中的表达对该类疾病发病机制的探讨具有重要的价值。然而SOD 1在正常人体内的表达情况如何,目前未见有相关报导。目的：本实验收集了正常人外周静脉血,观察不同年龄段正常人静脉血的SOD1表达水平,为后续研究神经变性病尤其是ALS患者体内的SOD1表达做出前期的方法探索和数据积累。方法：随机抽取北京协和医院体检中心正常健康人血样120人份,收集一个ALS家系中正常成员(目前无ALS临床症状)血样10份,年龄范围8个月至78岁。每位受检者分别收集抗凝的检验用全血约1000μ1,血清约500μ1。采用Western blotting的方法检测SOD1蛋白的表达,黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性水平。结果：随着年龄的增加,外周静脉血单核细胞中SOD1蛋白表达水平是增加的,40-50岁左右SOD1蛋白水平达高峰,此后逐渐下降。正常人出生后总SOD活性呈下降的趋势,至20岁之前,血清中总SOD活性处于相对高的水平0.13-0.16U/ml,20岁左右后,总SOD活性明显下降,随着年龄的增加,稍有波动,但一直维持在相对较低的水平0.07-0.08U/ml。结论：1正常人外周血单核细胞中SOD1蛋白的表达随着年龄增加逐渐增加,40-50岁达高峰,60岁以后表达水平逐渐降低。2正常人血清总SOD活性在出生后至20岁,处于相对高的水平,20岁左右后,SOD活性明显下降,随着年龄的增加,稍有波动,但一直维持在相对较低的水平。

全文目录


英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-12
英文摘要  12-18
第一部分 丁基苯酞治疗与预防肌萎缩侧索硬化SOD1-G93A转基因小鼠的实验研究  18-72
  引言  18-19
  材料和方法  19-31
  结果  31-45
  讨论  45-54
  结论  54
  创新点  54-55
  参考文献  55-66
  附图  66-72
第二部分 正常人外周静脉血SOD1蛋白表达水平的检测  72-88
  引言  72-73
  研究和方法  73-79
  结果  79-82
  讨论  82-85
  结论  85
  创新点  85-86
  参考文献  86-88
综述一  88-93
  参考文献  91-93
综述二  93-100
  参考文献  97-100
综述三  100-107
  参考文献  103-107
致谢  107-108

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脊髓疾病
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