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BMCs膜片与种植体复合共培养促进2型糖尿病大鼠骨结合

作　者: 于淼
导　师: 宋应亮
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: MSCs 种植体细胞膜片 2型糖尿病骨结合
分类号: R783
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

自上世纪50年代中期Branemark教授发现钛的生物相容性以来,口腔种植技术取得迅猛发展,如今已成为牙列缺损、缺失及颜面部缺损患者最理想的义齿修复及固位方式,其应用的关键是种植体与颌骨形成良好的骨结合。然而,全身系统性疾病如糖尿病可引起多种并发症,对种植体周围骨组织愈合产生不良影响,具有发生种植体失败的风险因素,一直被认为是种植外科手术的相对禁忌症。分析原因可能由于骨种植体结合的性能及伤口愈合较差导致。目前报道的解决办法主要是全身控制血糖,包括口服降糖药及胰岛素治疗等。胰岛素可直接或间接刺激成骨细胞形成,并降低糖尿病对骨种植体结合的有害作用。尽管如此,关于胰岛素完全的积极作用尚存在一定争议,且对于中、重度糖尿病患者,胰岛素只能部分恢复糖尿病带来的病理效应。因此,如何针对中、重度糖尿病缺牙患者,提高种植体成功率成为亟待解决的难题。本实验中,我们拟采用组织工程细胞膜片技术将骨髓基质细胞与种植体进行体外复合,构建具有生物活性的细胞膜片组织工程化种植体,并诱导成骨后植入已构建好的2型糖尿病动物模型体内,分析测定种植体骨结合情况,探讨此技术在中、重度糖尿病缺牙患者种植领域应用的可行性,以期为临床上解决中、重度糖尿病患者种植体失败率高的问题提供思路和方法。主要的实验方法及结果:1.采用高脂高糖饲料合并STZ小剂量多次腹腔注射方法构建2型糖尿病种植研究模型选择50只健康雄性Wista大鼠,体重均为200-250g,随机将其分为两组,糖尿病造模组40只,对照组10只。所有动物饲养于SPF环境,糖尿病造模组用高脂高糖饲料喂养,对照组用普通饲料喂养。各自饲料喂养8周后,空腹12h,称重,剪尾取血测量血糖。STZ溶液按剂量(30mg/kg)对实验组大鼠腹腔注射,对照组大鼠腹腔注射PH=4.4枸橼酸缓冲液作为对照,剂量0.25 mL/kg。两组大鼠注射后,每周对大鼠进行体重血糖动态监测,随机血糖值大于16.7mmol/L或300mg/dL表示2型糖尿病大鼠造模成功,如未达要求进行再次注射。统计造模成功率,对血糖值达到标准的大鼠进行IPGTT及ITT试验,确定2型糖尿病发病,结果显示,STZ注射后1-4周糖尿病造模组大鼠体重仍持续上升,血糖稳定,对照组大鼠注射后体重血糖均稳定,糖尿病造模组大鼠体重血糖均明显高于对照组(P<0.05)。40只糖尿病造模组大鼠36只血糖达标,造模成功率90%。IPGTT结果显示两组大鼠血糖值均在腹腔注射葡萄糖溶液30分钟时达最高值,随后90分钟下降,糖尿病造模组血糖持续明显高于对照组(P<0.05)。ITT结果显示对照组大鼠腹腔注射胰岛素后血糖分数急剧降低,而糖尿病造模组大鼠血糖分数注射后30min较平稳,随后下降趋势与对照组类似。注射后120min内糖尿病造模组血糖分数持续高于对照组(P<0.05)。以上结果说明:与对照组大鼠相比,糖尿病造模组大鼠体重血糖均升高,腹腔注射STZ 4周后,糖尿病造模组大鼠表现出一定的胰岛素抑制,类似人类2型糖尿病特点。2.应用细胞膜片技术构建大鼠BMCs组织工程化种植体取两周龄Wista幼鼠骨髓基质用全骨髓培养法获得P2代较纯化的骨髓间充质干细胞并进行体外培养,制备成具有一定机械强度,可操作性强的细胞膜片,紧密包裹于经微弧氧化(MAO)处理的钛种植体周围,复合物共培养并诱导成骨,通过大体观察及组织学方法分析复合物生物学特性。结果显示:包裹种植体的细胞膜片仍保持活力,分泌大量细胞外基质,扫描电镜图可见种植体表面细胞呈条索状,排列紧密,上有较密集均一的矿质小球形成。共培养成骨诱导后的膜片茜素红染色可见明显的钙结节阳性表达,提示膜片成骨作用明显。以上结果说明:应用细胞膜片技术将较纯化的骨髓间充质干细胞与种植体复合共培养构建组织工程化种植体具有良好的生物活性及成骨能力。3.将BMCs种植体复合物植入2型糖尿病模型体内,观察骨结合情况将36只2型糖尿病大鼠随机分为两组,每组n=18,分别为干细胞治疗组及钛种植体组。将制备好的组织工程化种植体植入干细胞治疗组大鼠胫骨,钛种植体植入钛种植体组。术后4周取两组大鼠各9只进行MicroCT整体及局部扫描,确定HU(亨斯菲尔德单位),分析数据并对扫描图像进行三维重建。随后将经MicroCT扫描后的大鼠处死,取胫骨,包埋,硬组织切片机切成厚约40μm不脱钙硬组织切片,丽春红三色染色后置于光镜下观察骨结合情况,术后8周对两组剩余的各9只老鼠做与4周相同处理。结果显示:(1)MicroCT三维重建图像可见,术后4周时,两组2型糖尿病大鼠种植体均形成骨结合,但干细胞治疗组种植体周围骨量明显高于钛种植体组。术后8周时,干细胞治疗组种植体周围形成的骨组织较厚,排列规则,而钛种植体组骨小梁排列稀疏,质地薄弱(2)选择种植体周围距表面0.5mm区域为感兴趣区域,MicroCT相关软件分析该区域相关骨小梁参数,得植入术后4周时,干细胞治疗组大鼠种植体骨结合率(BIC)明显高于对照组,术后8周时,干细胞治疗组BIC,骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁数目(Tb.N),骨表面积分数(BS/BV)及骨体积分数(BV/TV)均明显高于钛种植体组,而骨小梁间隔(Tb.Sp)与钛种植体组相比明显降低,以上均有P<0.05,说明干细胞治疗组骨密度及骨量明显高于钛种植体组(3)丽春红三色染色硬组织切片光镜下观察可见,术后4周时,钛种植体组种植体周围骨组织排列紊乱,与种植体间形成一层纤维状连接,术后8周时,种植体周围骨组织仍然较稀疏,可见骨与种植体间有空隙形成,连续性较差。而干细胞治疗组种植体与周围骨组织结合较为紧密,骨小梁排列有序,连续性较好(4)组织切片相关数据分析得出术后4周及8周,干细胞治疗组大鼠骨结合率(BIC)均明显高于钛种植体组(P<0.05)以上结果说明,骨髓间充质干细胞组织工程化种植体可促进2型糖尿病大鼠种植体骨结合。结论:针对中、重度糖尿病缺牙患者,将干细胞组织工程技术应用于糖尿病缺牙种植领域可行,为提高中、重度糖尿病缺牙患者种植体成功率提供了新的思路及实验基础。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-11
Abstract  11-17
前言  17-19
文献回顾  19-37
实验一构建2型糖尿病动物模型  37-44
  1. 材料  37-39
  2. 方法  39-40
  3. 结果  40-42
  4. 讨论  42-44
实验二构建骨髓间充质干细胞种植体复合物  44-52
  1. 材料  44-45
  2. 方法  45-48
  3. 结果  48-51
  4. 讨论  51-52
实验三观察分析BMCs细胞膜片种植体复合物植入2型糖尿病大鼠的骨结合  52-62
  1. 材料  52-53
  2. 方法  53-56
  3. 结果  56-59
  4. 讨论  59-62
小结  62-63
参考文献  63-77
个人简历和研究成果  77-78
致谢  78

BMCs膜片与种植体复合共培养促进2型糖尿病大鼠骨结合

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