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脱氧鬼臼毒素对大鼠背根神经节和美洲大蠊背侧不对称中间神经元离子通道作用研究

作　者: 孙芹
导　师: 高蓉；肖杭
学　校: 南京医科大学
专　业: 营养与食品卫生
关键词: 美洲大镰 背侧不对称中间神经元 章鱼胺 免疫化学 脱氧鬼臼毒素 背根神经节 高电压激活钙电流 细胞膜电位 钠通道 全细胞膜片钳
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


第一部分脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊背侧不对称中间神经元的作用研究优化美洲大蠊（Periplaneta americana）中枢神经系统背侧不成对中间（dorsal unpaired median,DUM）神经元的分离条件并对其鉴定。采用胶原酶消化美洲大蠊末端腹神经节,机械吹打得到DUM神经元,使用章鱼胺抗体染色和免疫荧光法对DUM神经元进行鉴定。分离得到的DUM神经元具有典型的梨状形态和表面特征,能够存活13天。免疫荧光染色结果符合DUM神经元特征。说明美洲大蠊DUM神经元细胞的分离优化方法可靠,为进一步研究其生物学特性提供实验模型。研究脱氧鬼臼毒素（deoxypodophyllotoxin,DOP）对美洲大蠊DUM神经元膜电位的影响及其与钠通道的关系。分别用终浓度为1、5、25、125μmol/L的DOP作用于荧光染料DiBAC4（3）标记的美洲大蠊DUM神经元,在激光共聚焦显微镜上监测神经元膜电位的实时动态变化,并观察钠通道阻断剂河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）对DUM膜电位效应的影响。结果显示:加入DOP后美洲大蠊背侧不成对中间神经元膜电位呈去极化改变,5 min后达到最大水平,8 min趋于稳定。1、5、25、125μmol/L的DOP作用5 min后所测得的荧光强度值分别为69.6±3.0、72.1±2.7、77.8±3.6、86.2±3.1,药物处理组和空白对照组相比差异均有统计学意义（P < 0.01）。1μmol/L TTX与美洲大蠊背侧不成对中间神经元共孵育20 min后再加入25μmol/L DOP所测值为63.6±5.4,与对照组相比差异无统计学意义（P > 0.05）,说明DOP的膜电位效应可被TTX完全抑制。实验证明:DOP可引起美洲大蠊背侧不成对中间神经元膜电位去极化,其效应在1-125μmol/L范围内随浓度增加而增大;钠通道参与了这一过程。以美洲大镰DUM神经元为模型,采用全细胞膜片钳技术观察DOP对其电压激活钠通道电生理特性的影响。结果表明:DOP以浓度依赖和电压依赖的方式抑制钠电流,浓度效应曲线的Hill系数大于1。100μmol/L的DOP使钠电流激活曲线和失活曲线均向超极化方向移动,激活的调节作用大于失活的调节作用,通道开放的电位范围减小,导致DUM神经元兴奋性升高。采用钙离子荧光探针技术,激光共聚焦显微镜观察DOP对美洲大镰DUM神经元胞内游离钙荧光强度的作用。结果表明:在有钙和无钙外液中加入DOP均引起DUM胞内游离钙荧光强度升高,说明DOP引起钙离子浓度的升高是由胞外钙的内流和胞内钙库释放共同引起的。有钙外液中预孵100μmol/L钙阻断剂CdCl2,再加入25μmol/L DOP后,DUM胞内游离钙荧光强度相对降低,说明外钙内流是重要原因。第二部分脱氧鬼臼毒素对大鼠背根神经节神经元的作用研究DOP对大鼠背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）神经元膜电位的影响及其与钠通道的关系。分别用终浓度为1、5、25、125μmol/L的DOP作用于荧光染料DiBAC4（3）标记的大鼠DRG神经元,在激光共聚焦显微镜上监测神经元膜电位的实时动态变化,并观察钠通道阻断剂TTX对DOP膜电位效应的影响。结果显示:加入DOP后大鼠DRG神经元膜电位呈去极化改变,5 min后达到最大水平,8 min内趋于稳定。1、5、25、125μmol/L的DOP作用5 min后,所测得的荧光强度值分别为62.3±2.1、63.8±3.6、68.5±3.8、88.1±5.4,与空白对照组相比差异均有显著性（P < 0.01）。1μmol/L TTX与大鼠DRG神经元共孵育20 min后再加入25μmol/L DOP所测值为57.5±2.3,与对照组相比无显著差异（P > 0.05）,说明DOP的膜电位效应可被TTX完全抑制。实验表明:DOP对大鼠DRG神经元和美洲大蠊DUM神经元膜电位作用相似,可引起背根神经节神经元膜电位去极化,且其效应在1-125μmol/L范围内随浓度增加而增大,钠通道参与了这一过程。以大鼠DRG神经元为模型,采用全细胞膜片钳技术观察DOP对高电压激活钙通道电生理特性的影响。结果表明:DOP以浓度依赖和电压依赖的方式抑制高电压激活钙电流,浓度效应曲线的Hill系数大于1。100μmol/L的DOP使DRG神经元高电压激活钙电流的激活曲线向去极化方向移动,表明钙通道对电压的改变的敏感型降低,使得钙通道不容易被激活,最终导致细胞膜的兴奋性降低。100μmol/L的DOP使DRG神经元高电压激活钙通道的失活曲线向极化方向发生移动,说明DOP与失活了的钙通道发生了结合,使之处于稳定的失活状态,因此减少了在正常静息状态下能够响应去极化刺激的钙通道的数目,DOP对钙通道这种调节作用,将导致处于失活状态的钙通道的不断增多,从而使细胞对外界刺激失敏。采用钙离子荧光探针技术,用激光共聚焦显微镜观察DOP对大鼠DRG神经元胞内游离钙荧光强度的作用,研究DOP对大鼠DRG神经元胞内游离钙离子浓度的作用。实验结果表明:在有钙和无钙外液中加入DOP,DRG胞内游离钙荧光强度均升高,说明DOP作用于DRG神经元,一方面开放细胞膜钙通道,加强Ca2+内流,另一方面刺激胞内钙库释放Ca2+,双重作用引起胞内游离钙浓度升高,其作用机制与DUM类似。在无钙外液中,预孵IP3受体拮抗剂100μmol/L 2-APB（2-aminoethoxydiphenyborate）或者RYA受体拮抗剂5μmol/L DAN（2,3-diaminonaphthalene）,再加DOP,DRG胞内钙荧光强度升高不明显,说明DOP通过IP3受体和RYA受体共同控制胞内钙库释放,引起胞内游离钙荧光强度的升高。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
引言  11-13
第一部分 DOP对美洲大蠊DUM神经元的作用  13-37
  第一节 美洲大蠊DUM神经元的鉴定  13-18
  第二节 DOP对美洲大蠊DUM神经元膜电位的影响  18-23
  第三节 DOP对美洲大蠊DUM电压神经元门控钠通道的作用  23-31
  第四节 DOP对美洲大蠊DUM胞内游离钙离子的作用  31-37
第二部分 DOP对大鼠DRG 神经元的作用  37-56
  第一节 DOP对大鼠DRG神经元膜电位的影响  37-42
  第二节 DOP对大鼠DRG神经元高电压激活钙电流的作用  42-50
  第三节 DOP对大鼠DRG神经元胞内游离钙离子的作用  50-56
参考文献  56-61
文献综述  61-76
  参考文献  70-76
攻读学位期间发表文章情况  76-77
致谢  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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