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不同化感物质作用下五爪金龙的生理生化反应及蛋白质组学研究

作　者: 孙延杰
导　师: 庄东红；马瑞君
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 五爪金龙化感作用保护酶系丙二醛二维电泳
分类号: S451
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文利用4种单体化感物质,分别为茶碱、香草酸、(Z)-2-(2,3-二甲氧基苯基亚甲基)-6-羟基苯并呋喃-3(2H)-酮(编号081110)’和(Z)-2-(3-吡啶基亚甲基)-4,6-二甲氧基苯并呋喃-3(2H)-酮(编号090710)处理粤东及整个华南地区危害最为严重的入侵杂草之一的五爪金龙(Ipomoea cairica (Linn.) Sweet),以保护酶系统的变化为指标之一,同时分别提取经4种化感物质处理1天后的五爪金龙叶片和根尖的总蛋白质,进行二维电泳,以蛋白质斑点变化情况为另一指标,观察这4种化感物质是否能有效影响五爪金龙的这两个指标,同时观察不同化感物质对五爪金龙的根尖和叶片的蛋白质影响是否有一定的规律性,为筛选出对五爪金龙具专一性或高效性的化感物质,使我们的研究结果距实际应用更进一步,为植物源除草剂的开发奠定基础。本研究通过对不同化感物质作用下对五爪金龙的叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、以及丙二醛(MDA)含量进行测定,并进一步利用二维电泳技术对五爪金龙在4种化感物质的作用下蛋白质的变化进行研究,试验结果显示,在设定化感物质的浓度为2mmol·L-1时,五爪金龙的叶绿素含量在培养初期变化不明显,随着培养时间的延长与对照相比各处理组叶片均明显变黄；其中经081110处理的五爪金龙叶片边缘在第培养7天后出现黑斑。通过测定处理组五爪金龙的保护酶系结果显示除090710外,其余三种化感物质对五爪金龙有一定的影响,表现为SOD、CAT都呈现先上升后下降的趋势；POD活性除香草酸呈现先下降后上升外其余都皇现先上升后下降趋势；丙二醛含量除090710呈现持续下降外,其余三种化感物质均呈现持续上升趋势。对五爪金龙根和叶片的蛋白提取方法,二维电泳条件进行了优化。结果表明：称取0.08g新鲜根尖组织,加入1.6ml提取液[10%的三氯乙酸(TCA)溶解于丙酮溶液并含有0.07%的β巯基乙醇]等电聚焦[pH(3-10)梯度胶条(11cm)二维电泳银染]的合适的蛋白质上样浓度40μg；等点聚焦条件为30000V·h时,2-DE图谱蛋白质点多且清晰。且四种化感物质对五爪金龙的叶片和根尖的蛋白质组都有明显的影响,其中利用香草酸对五爪金龙叶片进行处理,通过肉眼观察可得到31个明显发生变化的斑点,其中新增斑点1个,上调斑点21个,下调斑点9个；根尖处理可得到22个明显发生变化的斑点,其中新增斑点2个,缺失斑点1个,上调斑点18个,下调斑点1个。利用茶碱对五爪金龙叶片进行处理,通过肉眼观察可得到27个明显发生变化的斑点,其中新增斑点5个,上调斑点19个,下调斑点3个；根尖处理可得到16个明显的斑点,其中新增斑点12个,下调斑点4个。利用(Z)-2-(2,3-二甲氧基苯基亚甲基)-6-羟基苯并呋喃-3(2H)-酮(编号081110)对五爪金龙叶片进行处理,通过肉眼观察可得到29个发生明显变化的斑点,其中缺失斑点7个,上调斑点4个,下调斑点18个；根尖处理可得到31个明显的斑点,其中新增斑点5个,上调斑点10个,下调斑点16个。利用(Z)-2-(3-吡啶基亚甲基)-4,6-二甲氧基苯并呋喃-3(2H)-酮(编号090710)对五爪金龙叶片进行处理,通过肉眼观察可得到33个发生明显变化的斑点,其中缺失的斑点有8个,上调斑点6个,下调斑点19个；根尖处理可得到30个明显变化的斑点,其中新增斑点9个,上调斑点18个,下调斑点3个。比较不同化感物质对五爪金龙的根尖和叶片的蛋白质的想是否具有一定的规律性,结果发现,经090710处理的五爪金龙,主要影响其信号转动系统；经茶碱和香草酸处理的五爪金龙,主要影响其能量系统和抗氧化系统；经081110处理的五爪金龙其规律性不详,有待于进一步研究。其中这些蛋白的功能涉及光合作用、抗氧化、能量代谢、信号转导以及基因转录有关。其中最主要的蛋白有：细胞色素合成酶、以柠檬酸脱氢酶、ATP合成酶亚基、内含子编码蛋因子、谷氨酸受体、核糖体蛋白S11、这些蛋白质与植物适应胁迫环境均有关系。结果表明：1.4种化感物质中除090710对五爪金龙保护酶系统不敏感外,其他三种化感物质都有一定的影响。2.总蛋白的提取方法优化结果为：以TCA-丙酮法提取五爪金龙根尖和叶片的总蛋白质的效果最佳。3.二维电泳条件的优化结果：新鲜组织0.08g,加入1.6ml提取液,等电聚焦pH(3-10)梯度,胶条(11cm)二维电泳银染的合适的蛋白质上样浓度40μg；等点聚焦条件为30000V·h时,2-DE图谱蛋白质点多且清晰。4.4种化感物质都对五爪金龙的根尖和叶片的蛋白质都有影响,其中经茶碱和香草酸处理的五爪金龙的蛋白质,主要影响其能量系统和抗氧化系统；经090710处理的五爪金龙,主要影响其信号转动系统；经081110处理的五爪金龙其规律性不祥,有待于进一步研究。这表明他们都可能成为较合适的植物源除草剂的备选化感物质成分。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
本文缩写词  7-11
第一章前言  11-14
  1.1 五爪金龙的介绍  11
  1.2 五爪金龙的研究现状及所遇到的问题  11-12
  1.3 植物的蛋白质组学研究进展  12-13
  1.4 研究目的和意义  13-14
第二章不同化感物质对五爪金龙生理生长及生化组成的影响  14-24
  2.1 材料来源及预培养  14
    2.1.1 单体化感物质的来源  14
    2.1.2 受体植物为五爪金龙  14
  2.2 试验方法  14
  2.3 测定方法  14-18
    2.3.1 数据分析方法  14-15
    2.3.2 叶绿素含量的测定  15
    2.3.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定  15-16
    2.3.4 过氧化氢酶(CAT)活性测定  16
    2.3.5 过氧化物酶(POD)活性的测定  16-17
    2.3.6 丙二醛(MDA)含量的测定  17-18
  2.4 结果与分析  18-22
    2.4.1 叶绿素含量的变化情况  18-19
    2.4.2 SOD活性变化情况  19
    2.4.3 CAT活性变化情况  19-20
    2.4.4 POD活性变化情况  20-21
    2.4.5 MDA含量变化情况  21-22
  2.5 结论和讨论  22-24
第三章五爪金龙全蛋白的提取及双向电泳技术的改进和优化  24-32
  3.1 材料与方法  25-27
    3.1.1 五爪金龙的来源与培养  25
    3.1.2 试剂和仪器  25
    3.1.3 蛋白样品的提取和制备  25-26
    3.1.4 蛋白浓度测定  26
    3.1.5 二维电泳  26-27
  3.2 试验结果  27-30
    3.2.1 不同蛋白提取方法对2-DE图谱的影响  27-28
    3.2.2 蛋白质上样量对二维电泳结果的影响  28-29
    3.2.3 不同等电聚焦电压对二维电泳结果的影响  29-30
  3.3 讨论  30-32
    3.3.1 蛋白提取方法的优化  30-31
    3.3.2 双向电泳条件的优化  31-32
第四章五爪金龙叶片在化感物质的作用下差异蛋白质组研究  32-44
  4.1 试验材料  32
  4.2 方法  32-34
    4.2.1 五爪金龙叶片全蛋白的提取制备  32
    4.2.2 双向电泳、染色及扫描  32
    4.2.3 图谱比对及切点  32
    4.2.4 肽质量指纹图谱分析  32-34
  4.3 结果与分析  34-44
    4.3.1 五爪金龙叶片在不同化感物质作用下的全蛋白2-DE分析  34-35
    4.3.2 五爪金龙叶片经不同化感物质处理蛋白质表达情况  35-37
    4.3.3 肽指纹质谱鉴定图  37-41
    4.3.4 不同化感物质作用下的五爪金龙叶片蛋白质谱鉴定结果  41-44
第五章五爪金龙根尖在不同化感物质作用下差异蛋白质组学研究  44-57
  5.1 试验材料  44
  5.2 方法  44-45
    5.2.1 五爪金龙根尖全蛋白的提取制备  44
    5.2.2 双向电泳、染色及扫描  44
    5.2.3 图谱比对及切点  44-45
  5.3 结果与分析  45-57
    5.3.1 五爪金龙根尖在不同化感物质作用下的全蛋白2-DE分析  45-46
    5.3.2 不同化感物质处理五爪金龙根尖和叶片蛋白质规律性变化情况  46-48
    5.3.3 五爪金龙根尖经不同化感物质处理蛋白质组变化情况  48-50
    5.3.4 肽指纹质谱鉴定图  50-54
    5.3.5 不同化感物质作用下的五爪金龙根尖蛋白质谱鉴定结果  54-57
第六章讨论与结论  57-62
  6.1 讨论  57-59
    6.1.1 信号传导  57
    6.1.2 能量和代谢  57-58
    6.1.3 氧化还原酶  58-59
    6.1.4 ABC转运蛋白  59
  6.2 结论  59-62
参考文献  62-67
致谢  67-68
附录五爪金龙图片  68

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