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迷迭香酸治疗肾间质纤维化的实验研究

作　者: 丁巍
导　师: 黄松明；张爱华
学　校: 南京医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 迷迭香酸肾小管上皮细胞转分化醛固酮活性氧族输尿管梗阻氧化应激丙二醛超氧化物歧化酶
分类号: R692
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)已经成为各种肾脏疾病进展到终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)的共同途径和主要病理学基础。在病理状态下,肾小管上皮细胞可以发生上皮细胞-间充质转分化(epithelial- mesenchymal transition, EMT),在肾间质纤维化过程中超过1/3的肌成纤维细胞是通过肾小管上皮细胞转分化而来的,因此EMT在肾间质纤维化过程中扮演着重要的角色。氧化应激是导致细胞损伤、衰老和死亡的重要原因之一。肾组织中需要较高的氧耗来完成水及电解质的主动转运和肾小管重吸收,所以肾小管极易受到损伤。如果氧自由基的产生不断增高或者体内的抗氧化平衡逐渐失调,过多的氧自由基将会引起肾组织细胞损伤,导致各种肾脏疾病。治疗肾脏疾病的常用药物如糖皮质激素、细胞毒药物等对慢性肾脏病有一定的治疗作用,但长期应用其副作用较大,因此迫切需要寻找一种既具有治疗效应而其副作用又较小的药物。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是一种水溶性多酚类化合物,广泛分布于唇形科中草药如迷迭香、紫苏中,因最初从迷迭香中分离提取而得名。RA具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗菌及免疫抑制等多种生物学活性。新近有研究发现,RA对大鼠MsPGN模型、IgA肾病模型具有保护作用,但对肾间质纤维化是否有效尚不清楚。为进一步探讨RA的作用机制,我们开展了以下两部分研究,从细胞与整体水平证实了RA对肾间质纤维化的影响。目的:应用醛固酮(Aldosterone, ALD)诱导人肾小管上皮细胞-间充质转分化(EMT),研究迷迭香酸(RA)对人肾小管上皮细胞转分化的影响并探讨其发生的机制。方法:体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),细胞同步化后给予ALD (100nM)刺激,同时加入不同浓度的RA(5μg/ml, 25μg/ml)和rotenone (ROT, 10μM)。实验分组如下:(1)正常对照组;(2)ALD (100nM)诱导组;(3)ALD(100nM)+RA(5μg/ml)干预组;(4)ALD (100nM)+RA(25μg/ml)干预组;(5)ALD(100nM)+线粒体呼吸链酶抑制剂rotenone (ROT, 10μM)干预组。应用倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;RT-PCR、Western blot法检测波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及钙粘蛋白(E-cadherin)的表达水平;Western blot法检测信号通路ERK1/2的磷酸化水平;荧光显微镜定性观察活性氧(ROS)表达情况;免疫荧光酶标仪定量检测活性氧(ROS)表达情况。结果:(1)与对照组相比,醛固酮诱导肾小管上皮细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞样形态;Vimentin mRNA和α-SMA蛋白表达上调, E-cadherin mRNA及蛋白表达均下调;ERK1/2磷酸化水平增高;活性氧族(ROS)表达显著增高。(2)不同浓度的RA(5μg/ml, 25μg/ml)及ROT(10μM)干预组与ALD (100nM)诱导组相比,Vimentin mRNA和α-SMA蛋白表达下调,E-cadherin mRNA及蛋白表达均上调;ERK1/2磷酸化水平下降;活性氧族(ROS)表达显著下降。结论:RA能够抑制醛固酮诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化,RA对EMT的负性调节作用可能是通过抑制ROS引起的ERK1/2信号转导途径实现的。目的:探讨迷迭香酸对小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型肾间质纤维化的抗氧化保护作用。方法:将雄性C57BL/6J小鼠随机分成三大组:假手术对照组(Sham组,n=8)、UUO模型组(结扎左侧输尿管制作UUO模型,n=24)、UUO迷迭香酸干预组(UUO+RA组,n=24)。除Sham组外,其余两组根据不同的观察时间细分为3、7、14d亚组(n=8)。术后第3、7、14天分别处死各组小鼠,组织病理学方法观察肾小管间质损伤情况;Western blot方法检测肾组织中波形蛋白(Vimentin)和E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达;比色法测定小鼠左肾皮质匀浆中脂质过氧化标志物MDA以及抗氧化酶SOD的含量。结果:UUO模型组与假手术组比较:随着模型损伤时间的延长,肾间质损伤程度逐渐加重,Vimentin和MDA含量明显增高,E-cadherin和SOD含量明显降低。迷迭香酸干预组与UUO模型组比较:3天时肾脏病理、Vimentin、E-cadherin以及MDA、SOD含量无明显改变;7天时肾间质纤维化减轻,Vimentin、MDA含量降低,E-cadherin、SOD含量增高;14天时肾间质纤维化明显减轻,Vimentin、MDA含量明显降低,E-cadherin、SOD含量明显增高。结论:迷迭香酸可能通过减少单侧输尿管梗阻侧肾皮质脂质过氧化物的产生、增加抗氧化酶的含量,从而改善小鼠氧化应激所致的肾间质纤维化。

全文目录

中文摘要  3-7
英文摘要  7-11
前言  11-15
第一部分迷迭香酸对醛固酮诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响及其机制研究  15-40
  材料与方法  17-31
  结果  31-38
  讨论  38-40
第二部分迷迭香酸对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的抗氧化保护作用  40-57
  材料与方法  42-47
  结果  47-54
  讨论  54-57
结论  57-58
参考文献  58-63
综述氧化应激与慢性肾脏病  63-72
  参考文献  67-72
附录一英文缩略词  72-73
附录二就读期间科研工作小结  73-74
致谢  74

迷迭香酸治疗肾间质纤维化的实验研究

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