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锌指蛋白TaCHP基因对小麦的转化

作　者: 刘法磊
导　师: 王敏琴
学　校: 山东大学
专　业: 遗传学
关键词: 普通小麦(Triticuma aestivum L.) 耐盐性农杆菌介导的生长点转化法 TaCHP基因
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 44次
引　用: 1次
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内容摘要

小麦(Triticuma aestivum L.2n=42)是人类赖以生存的四大作物之一,世界上1/3以上的人口以小麦为主食,小麦的产量直接关系到人类的生存问题,并在国民经济中起重要的作用。在各种非生物胁迫中,盐胁迫对植物的影响尤为突出。因盐害造成的作物减产和品质下降是粮食生产中亟待解决的难题。小麦为甜土植物,其抗盐性受复合多基因遗传性状遗传,且与品质优劣、产量高低等性状紧密连锁,采用常规育种方法来提高抗盐性,获得抗盐性强的优良新品种十分困难。随着分子生物学的发展,利用基因工程手段改良植物抗盐性,选育抗盐品种,在未来农业生产中具有广阔前景。转录因子是一类能够与真核基因启动子区域中的顺式作用元件相结合,与相关基因的表达调控相关。其中,锌指蛋白类转录因子种类繁多,且在抗旱、抗冻及抗盐胁迫中发挥重要作用。本研究所用的锌指蛋白TaCHP基因克隆自本课题组选育的耐盐渐渗小麦新品种山融3号(SR3),该品系是通过不对称体细胞杂交技术,将耐盐禾草(长穗偃麦草Agropyron elongatum 2n=70)的染色体小片段或/和DNA渐渗入普通小麦济南177(JN177)基因组得到的。前期在拟南芥研究中发现,生长在含有100和150mM NaCl的培养基上的拟南芥转TaCHP基因植株,叶片和根系的生长都好于对照。本论文利用农杆菌介导的生长点法,将构建于pUN1301载体上的TaCHP基因,对不同品种小麦进行基因转化。1.采用农杆菌介导的生长点法,对5种不同基因型的小麦进行TaCHP基因的转化；分别成活种苗：济麦17(430棵)、济麦22(552棵)、扬麦15(240棵)、龙麦30(520棵)、周麦(408棵)；以100mg/L潮霉素,涂抹两叶一心的T0代转基因小苗,不同基因型的五种小麦潮霉素抗性出现差异。2.以UTA和TF8S引物进行转化苗的PCR检测,分别得到的TO代种子33、58、3、17、0粒,该结果说明生长点转化法存在基因型依赖性。继续对T1和T2代转化苗进行PCR检测,发现外源目的片段的插入率逐渐降低,可能是嵌合体的影响或外源基因插入到叶分生组织靶细胞所致。3.通过温室加代培养T2代阳性植株至T4代,选取southern杂交检测为阳性的植株,通过RT-PCR对TaCHP基因的表达进行分析。利用200mM的NaCl对转基因小麦处理0,3,6,12,24h,发现该基因在转基因小麦的根和叶的表达量随处理时间增加,成上调趋势。4.用0,100,200mM NaCl处理T4代植株以及对照株系14d,并对叶片中脯氨酸、丙二醛、POD、CAT等生理指标进行测定分析。在100,200mM的盐浓度下,转基因与未转基因植株中的脯氨酸含量均有升高,但是转基因植株的升高更加明显；而随着盐浓度升高,转基因与未转基因植株丙二醛的含量均升高,但是转基因植株的升高相对较低；相对于非转基因植株,转基因小麦在盐处理下,POD、CAT的活性更高。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
符号说明  10-11
第一部分文献综述  11-25
  一植物盐害机制研究现状  11
  二植物耐盐机制  11-14
    2.1 渗透调节  12-13
    2.2 活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的去除  13-14
    2.3 离子平衡  14
  三植物应答盐胁迫分子机理  14-19
    3.1 植物逆境胁迫应答基因转录水平的表达调控  14-16
    3.2 植物转录因子的特征与分类  16
    3.3 植物抗逆相关转录因子  16-19
  四植物转基因研究  19-22
    4.1 植物基因工程育种研究  19-20
    4.2 小麦基因工程研究  20
    4.3 植物转基因方法  20-22
  五转基因后代的检测方法  22-24
    5.1 标记基因的筛选与检测  22-23
    5.2 PCR检测  23
    5.3 Southern blotting  23
    5.4 RT-PCR  23-24
  六本研究的目的和意义  24-25
第二部分材料和方法  25-35
  一实验材料,转化所用菌株,目的基因和质粒载体结构  25
    1.1 实验材料  25
    1.2 转化所用菌株,目的基因和质粒载体结构  25
    1.3 目的基因  25
  二质粒提取  25-26
    2.1 质粒提取  25-26
    2.2 酶切鉴定  26
  三农杆菌对小麦的转化  26-27
    3.1 菌液的制备  26-27
    3.2 小麦生长点转化  27
  四转基因植株的筛选与鉴定  27-32
    4.1 转基因植株的筛选  27
    4.2 PCR鉴定  27-28
    4.3 Southern杂交鉴定  28-31
    4.4 RT-PCR  31-32
  五转基因植株后代的生理指标测定  32-35
    5.1 脯氨酸(pro)  32-33
    5.2 丙二醛(MDA)  33-34
    5.3 过氧化氢酶(CAT)活性  34
    5.4 过氧化物酶(POD)活性  34
    5.5 数据分析  34-35
第三章实验结果及分析  35-45
  1 生长点法转化  35-38
    1.1 TO代转基因小麦的潮霉素筛选  35-36
    1.2 TO代生长点法转基因植株的PCR检测  36-38
  2 T1、T2代转基因阳性植株的分析  38-39
    2.1 T1代植株的萌发及阳性率  38
    2.2 T2代转基因植株的萌发及阳性率  38-39
    2.3 T3代转基因植株的大田中生长  39
  3 T4代转基因植株的分子遗传学分析  39-45
    3.1 部分T4代阳性植株的Southern杂交  39-40
    3.2 T4代转基因小麦的RT-PCR分析  40-41
    3.3 T4代转基因小麦的耐盐性分析  41
    3.4 T4代转基因小麦生理指标测定  41-45
第四部分讨论  45-49
  一生长点转化法与受体基因型  45
  二影响TO代小麦(农杆菌介导的生长点转化法)结实的因素  45-46
  三目的基因的稳定性  46
  四转TaCHP基因的小麦株系中TaCHP的RT-PCR分析  46-47
  五转TaCHP基因的小麦的耐盐性分析  47-49
参考文献  49-56
致谢  56-57
硕士研究生在读期间发表文章情况  57
硕士研究生在读期间获奖情况  57
硕士研究生在读期间参与科研项目  57-58
学位论文评阅及答辩情况表  58

锌指蛋白TaCHP基因对小麦的转化

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